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(無題) 削除/引用 No.9019-6 - 2020/07/15 (水) 18:17:50 - 薬剤 totoさん ＞私らもかつて同じようなことを経験しました。tdTomatoは培養細胞ではがんがんに赤く光って見えますが、組織になるとおそらく自家蛍光に埋もれるようです。仕方なくＲＦＰ抗体で染めて論文にしました。ちょっとがっかりでした。 貴重な情報ありがとうございます。 どうも同じ感じのようです。 RFPで染めて解析を進めることにします。

(無題) 削除/引用 No.9019-5 - 2020/07/15 (水) 13:07:07 - toto 私らもかつて同じようなことを経験しました。tdTomatoは培養細胞ではがんがんに赤く光って見えますが、組織になるとおそらく自家蛍光に埋もれるようです。仕方なくＲＦＰ抗体で染めて論文にしました。ちょっとがっかりでした。

(無題) 削除/引用 No.9019-4 - 2020/07/15 (水) 12:29:49 - 薬剤 AAさん ＞実際、細胞特異的なレポーターとして蛍光タンパクを入れたけど観察できない、ということは頻繁にあります。 幸い、RFP抗体で見られるようなのでそれで良いのではないかと思います。 なるほど、やはりこういったことは頻繁に起こるものなのですね。 ありがとうございます。 おおさん ＞このときの検出方法（固定は？） MEFレベルでの検出の際はPFA4%で10分固定し、 蛍光顕微鏡で確認しました。

(無題) 削除/引用 No.9019-3 - 2020/07/15 (水) 12:05:08 - おお >MEFレベルでは検出 このときの検出方法（固定は？）

(無題) 削除/引用 No.9019-2 - 2020/07/15 (水) 11:37:40 - AA 単に発現量が少ないのだと思います。 培養線維芽細胞であれば視野内には均一な細胞しかないですが、組織なら多様な細胞の集合なので発現している細胞が少なければシグナルは弱くなります。 また、vitroとvivoでは環境も違うので同じ細胞であっても任意の遺伝子の発現量は同一ではないと思います。 実際、細胞特異的なレポーターとして蛍光タンパクを入れたけど観察できない、ということは頻繁にあります。 幸い、RFP抗体で見られるようなのでそれで良いのではないかと思います。 中にはRT-PCRでは検出されるけど抗体染色でも見られないケースもあります。

tdTomatoの蛍光が見えない 削除/引用 No.9019-1 - 2020/07/15 (水) 10:59:50 - 薬剤 tdTomatoを2Aペプチドで挟んで調べたい遺伝子の下流にノックインした遺伝子組み換えマウスを作成しました。 MEFレベルではtdTomatoの蛍光を観察できるのですが、 個体レベルではtdTomatoの蛍光を観察できません。 調べたい遺伝子の発現が多い組織においてもtdTomatoの蛍光が観察できないことが気になり、RFPの抗体で免疫染色したところ検出することができました。 （ウエスタンブロット、RT-qPCRではtdTomatoを確認できています） MEFレベルでは検出できて、個体レベルで検出できないということは蛍光が薄すぎて検出できていないのでしょうか？ tdTomatoの蛍光強度はかなり強いと聞いていたのですが、いろいろ工夫しても個体の組織レベルで蛍光は確認できていません。 自分も似たような事があったという方や、 蛍光に詳しい方いましたらご教授願います。

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