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(無題) 削除/引用 No.9018-11 - 2020/07/16 (木) 08:18:30 - たい 皆様 色々な方法を教えていただいてありがとうございます。 高性能のTaqを使ったり、KODのあとにTaq処理したり、平滑末端でも使えるベクターを用いたり、色々な方法があるんですね。

(無題) 削除/引用 No.9018-10 - 2020/07/16 (木) 06:53:54 - おお おそらくもう前に示したリンクを見ていると思いますが、 お持ちのKODなどで増やした断片にTaqでAをつけることができるので、手持ちのKODなどでふやしながらTaqを購入してきたらAをついかしたらいいかなと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.9018-9 - 2020/07/15 (水) 14:35:00 - G25 普通のTaqでも1400bpくらいだったらno errorのクローンは無理なく取れると思う。 ExTaqはTaqと校正活性のある耐熱性ポリメラーゼのカクテルだったはずで、ストレートなTaqより正確性や伸長性で有利。メーカーが言うにはたしか、末端の2/3程度はA突出だというから、TAクローニングに著しく不利というわけじゃないだろう。いい選択だと思います。

(無題) 削除/引用 No.9018-8 - 2020/07/15 (水) 12:25:28 - とおりすがりん 実験医学で紹介されていた本橋先生の開発されたベクターを使うと、KODなどの平滑でも楽にできるかもしれません。 http://www.cc.kyoto-su.ac.jp/~motohas/motohashi_lab/oyakudachi_others_PCRcloning.html

(無題) 削除/引用 No.9018-7 - 2020/07/15 (水) 12:12:35 - TA Easy-A High-Fidelity PCR Cloning Enzyme この酵素を使ってインサートの長さが4kbp以下の発現ベクターを20個超作ったけれど、問題が起きたことは一度も無いです。3つか4つのコロニーをピックアップしてミニプレップ、制限酵素で切って大きさを確認した後にうち2つをシークエンスにかけてるけれど、両方に予期せぬ変異があったのでやり直し、なんて目にあったこと一度も無いです。スペック表で見ればそこまで高性能な酵素では無いのかもしれませんが、かなりお気に入りです。

(無題) 削除/引用 No.9018-6 - 2020/07/15 (水) 12:02:36 - おお https://openwetware.org/wiki/Addition_of_3%27_A_overhangs_to_PCR_products

(無題) 削除/引用 No.9018-5 - 2020/07/15 (水) 10:54:02 - noname 増幅時のエラーがとても気になるのであれば KODで増幅後dA付加ですね。 TOYOBOであれば10×A-attachment Mixというものがあります。 774さんが言っているように精製したPCR産物へ dNTPのかわりにdAのみMixに加えて反応させると市販のキットのようにできます。 エラーがそれほど気にならないのであれば Taqタイプの酵素でよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9018-4 - 2020/07/15 (水) 10:36:13 - たい ありがとうございます。いずれもたいへん参考になります。 いずれにしても改めてtaqを購入しなければならないので、まずは教えていただいたTAKARAの酵素を購入してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9018-3 - 2020/07/15 (水) 10:20:46 - 774 精製したPCR産物にTaqでA付加だけさせて、 もう一度精製すればTAクローニングに使えると聞きました。 なるほどなーと思った記憶がありますが、なにせ随分昔の話なので勘違いだったらすみません。

(無題) 削除/引用 No.9018-2 - 2020/07/15 (水) 10:08:20 - AA TakaraのExTaqやLAtaqがいいと思います

TAクローニングに適したPCRのポリメラーゼ 削除/引用 No.9018-1 - 2020/07/15 (水) 10:06:07 - たい いつも勉強させていただいております。 今回、PCRで1400bpくらいのインサートDNAを回収した後、TAクローニングを試したいと思っています。 いつもはポリメラーゼとして東洋紡のKOD oneを使っているのですが、この酵素ではPCR産物は平滑末端になってしまうので、TAクローニングするにはあとからアデニン付加が必要と書かれていました。 できればTaqなどを使って、最初からアデニン付加されたPCR産物を使うことができればいいと思っているのですが、増幅させる配列の長さが1400bpと長いので、上手くいくかどうか若干心配しております。 Taqでどのくらいの長さの配列まで増幅可能なものでしょうか。 また、アデニン付加できるポリメラーゼで長い配列も増幅可能なおすすめのものがありましたら教えていただけないでしょうか？

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