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(無題) 削除/引用 No.9015-25 - 2020/07/17 (金) 02:12:50 - おお >[Re:24] G25さんは書きました : > > ただ、この手法だと、ゲル切り出しによってモノマーの自己環状化DNA（ニックのない）を取得するのはかなり見込みがありそうです。 > ライゲーション後に移動度が上がる（見かけ上の分子量が小さくなる）というものは、自己環状化DNAしか無いわけですし、とにかく一番、下のバンドを選べばモノマーのはずですから。 レスありがとうございます。気になるのはScale upで対応できるかというのもありますね。大きいゲルを使うとか、その時のDyeのRatioとかいじったほうがいいのかとか。

(無題) 削除/引用 No.9015-24 - 2020/07/16 (木) 18:46:32 - G25 >https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269718303816 >これとかLigationで大抵のプラスミドは１分子で自己閉環して、電気泳動できれいに別れているけどね。 面白い手法ですね。インターカレータを噛まして泳動するんですね。 ニックのない環状DNA（ライゲーション産物なのでスーパーコイル化していない）はイ 線形やニックのある環状DNAのようにフリーの末端があるDNAは、インターカレータが入り込こんだときの二重鎖の緩みを末端から逃がすことができるけれど、ニックのない環状DNA（ライゲーション産物なのでスーパーコイル化していない）はそれが出来ずに（スーパーコイルDNAがそうであるように）環状分子自体のツイストを起こしてかさ高さが小さくなるために、移動度が上がるようですね。EtBr/CsCl密度勾配超遠心によるプラスミドの精製にも通じるところがある。 ただ、モノマーしか見えない泳動像なんてのはよっぽどライゲーション反応の条件が上手く行ったときのチャンピオンデータだと思いますけれど。fig 2のサイズが異なるDNAでデモンストレートした図なんかでは、結構、エクストラバンドが出ているように見受けられます。 ただ、この手法だと、ゲル切り出しによってモノマーの自己環状化DNA（ニックのない）を取得するのはかなり見込みがありそうです。 ライゲーション後に移動度が上がる（見かけ上の分子量が小さくなる）というものは、自己環状化DNAしか無いわけですし、とにかく一番、下のバンドを選べばモノマーのはずですから。

(無題) 削除/引用 No.9015-22 - 2020/07/16 (木) 09:11:32 - おお >[Re:21] あおさんは書きました : > > おお様 > > 使おうと思っているDNAはHomoできれいに長さは揃っています。 > 文献ありがとうございます。確かにきれいなバンドですね。 > T4リガーゼ処理したところで、一部を泳動してみて、2分子、3分子体、直線状DNAのバンドが目視可能なくらいに出ているのであれば、 泳動の条件をよく見てから泳動してみてください。Ligationのコンディションも。 通常はRelaxed circularは多分Linear より上にくるのでLinearの２つがつながったものと結構近い位置に来る可能性があります。わたしは先に示した泳動条件は確認までしなかったのですが、自己閉環したRelaxed circularが下にきているので通常の泳動条件ではないのかなと。

(無題) 削除/引用 No.9015-21 - 2020/07/16 (木) 08:48:03 - あお AA様 これはすごいですね。大腸菌で直接、環状DNAを増幅させるというシステムですね。一読してもその原理がよく分からなかったので、もう少し詳しく読み込んでみます。 おお様 使おうと思っているDNAはHomoできれいに長さは揃っています。 文献ありがとうございます。確かにきれいなバンドですね。 T4リガーゼ処理したところで、一部を泳動してみて、2分子、3分子体、直線状DNAのバンドが目視可能なくらいに出ているのであれば、全体を泳動してゲル切り。全体がスメアをひいて切り出せなかったり、逆にきれいに1分子体だけのバンドしかなくて切り出す必要もない場合には、単純に精製(バッファと酵素の除去)だけする、という流れで行くのがいいかと思っております。あと、直線状DNA分解酵素をかけるかどうかもバンドを見て判断してみます。

(無題) 削除/引用 No.9015-20 - 2020/07/16 (木) 03:32:29 - おお あ、そうそう気になったことがあるのだけど、LigationしようとするDNAはHeteroで長さがまちまちなのか、Heteroでも長さが揃っているかHomoなのか、、、長さが揃っていれば電気泳動はやはり手だと私はおもう。

(無題) 削除/引用 No.9015-19 - 2020/07/16 (木) 03:29:34 - おお https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269718303816 これとかLigationで大抵のプラスミドは１分子で自己閉環して、電気泳動できれいに別れているけどね。

(無題) 削除/引用 No.9015-18 - 2020/07/15 (水) 17:12:21 - AA minicircle DNAをたくさん作る方法としては以下のようなものあるようです。 ttps://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21102455/

(無題) 削除/引用 No.9015-17 - 2020/07/15 (水) 16:30:10 - あお おお様 ありがとうございます。線形DNAを酵素で分解してしまうというのは一つの手ですね。 G25様 現段階ではそこまで単量体の自己環状化DNAだけを厳密に分取する必要はないですね。2量体、3量体(という言い方でいいのか分かりませんが)のような環状DNAが混じっていてもさほど問題にはなりません。 ゲル切り出しはやはり労力等々からあまり現実的ではなさそうですね。 単量体だけではなくて、2量体、3量体もそのまま残っていてかまいませんので、 T4リガーゼ反応後、反応後の酵素やバッファ等を取り除くという意味の「精製」をPCR産物と同様にして、もし丁寧にするなら、その前に線形DNAを酵素分解する、という感じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9015-16 - 2020/07/15 (水) 16:08:51 - G25 私が精製について尋ねたのは反応後、酵素の除去やバッファー交換をするという意味の精製ではなく「自己環状化したDNAの精製」のことです。ちなみに、T4 ligを失活させるならvortexみたいな制御不能な方法ではなく、熱失活をするものです。 >やはり、電気泳動で目的のサイズのバンドだけを切り出すというのも難しいでしょうか？それができれば環状化コンカテマーも取り除けそうな気がするのですが…。 電気泳動で出来ないことはないですが、労力対効果が見合うかどうか。 ライゲーション産物はいろいろな重合度の線形、環状が入り乱れ、バンドも近接します。どれが目的のバンドか見極めるの簡単ではないかも。ひょっとすると全体から見ると目的のバンドはマイナーで見えないかも。 通常のサブクローニングのときなんかのライゲーション産物を泳動してみたことがあれば、おわかりになるかと。 で、最初に戻って、自己環状化DNAをそれ以外のDNAから単離精製する必要がある実験なんだろうか、というのが私の疑問。

(無題) 削除/引用 No.9015-15 - 2020/07/15 (水) 16:07:28 - おお >[Re:14] あおさんは書きました : > > やはり、電気泳動で目的のサイズのバンドだけを切り出すというのも難しいでしょうか？それができれば環状化コンカテマーも取り除けそうな気がするのですが…。 https://www.lucigen.com/Plasmid-Safe-and-trade-ATP-Dependent-DNase/ まあこれ読んで。電気泳動でもかなり除けると思います。

(無題) 削除/引用 No.9015-14 - 2020/07/15 (水) 15:05:26 - あお 確かにT4 リガーゼをボルテックスで失活してしまえば、精製しなくてもバッファー類の残存はその後の実験にはあまり影響しないかもしれません。 >コンカテマーがさらに環状化したものも多くできるはずなので、線形DNA特異的酵素でも難しい。 やはり、電気泳動で目的のサイズのバンドだけを切り出すというのも難しいでしょうか？それができれば環状化コンカテマーも取り除けそうな気がするのですが…。 実際にしたことがないので、想像の話になってしまい、すみません。

(無題) 削除/引用 No.9015-13 - 2020/07/15 (水) 13:56:54 - G25 基質が酵素より過剰にあるような普通の反応系では、 反応速度は酵素量に比例すると考えられると思うんですけど、 >25μgのDNAでは概算で >4.2unitのT4リガーゼ、液量は83.3μlということでしょうか？ >確かに意外と少なくて済みそうですね… 同じ反応系でDNA量を増やしたらなそういう計算になりますが、30分の反応という条件ですからね。反応時間を数時間とか一夜とかにすればもっと少なくてもいいはずです。 >G25様の「反応体積をできる限り大きくして、DNA濃度を下げる」という方法を取るならバッファーの液量をその2倍、3倍(160μl, 240μl)くらいにしてみるのもありでしょうか？ もちろんありです。ただし、基質濃度、酵素濃度が下がるのでkineticsも下がることを考慮して反応時間を長く取るという配慮はあっていいでしょう。 >ちなみにT4DNAリガーゼで自己環状化したDNAの精製方法はどのようなものが考えられますでしょう？ 用途によっては精製する必要はないと思いますが、ダウンストリームの実験に不可欠なんですか？ コンカテマーがさらに環状化したものも多くできるはずなので、線形DNA特異的酵素でも難しい。

(無題) 削除/引用 No.9015-12 - 2020/07/15 (水) 12:43:19 - おお https://www.lucigen.com/Plasmid-Safe-and-trade-ATP-Dependent-DNase/

(無題) 削除/引用 No.9015-11 - 2020/07/15 (水) 12:32:29 - あお ちなみにT4DNAリガーゼで自己環状化したDNAの精製方法はどのようなものが考えられますでしょう？ コンカテマーを気にしないのであれば、通常のPCR産物精製と同じでいいのでしょうか。 それともアガロースゲルに泳動して切り出し？ でも、泳動すると環状化した場合、スメアになりそうで、切り出しにくそうな気もします。

(無題) 削除/引用 No.9015-10 - 2020/07/15 (水) 09:48:14 - あお なるほどありがとうございます。 例えばtakaraのT4 DNA ligase の場合 「6 μg/20 μlのλDNA-Hind III分解物を、16℃で約30分間に90％以上ライゲーションさせる酵素活性を1 Uとする。」 となっているので 25μgのDNAでは概算で 4.2unitのT4リガーゼ、液量は83.3μlということでしょうか？ 確かに意外と少なくて済みそうですね… G25様の「反応体積をできる限り大きくして、DNA濃度を下げる」という方法を取るならバッファーの液量をその2倍、3倍(160μl, 240μl)くらいにしてみるのもありでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9015-9 - 2020/07/15 (水) 09:20:33 - おお >[Re:8] 中年さんは書きました : > ligaseの単位の定義は次のようなものなので、条件が違うとはいえ数百ユニットでお釣りが来ると思います。 > > 「6 μg/20 μlのλDNA-Hind III分解物を、16℃で約30分間に90％以上ライゲーションさせる酵素活性を1 Uとする。」 > > 最適な反応容量は難しいところですが、現実問題として数百μl程度で良いのではないでしょうか。コンカテマーの形成がどのくらい問題になるかによりけりでしょうが。 単位の定義はメーカーによって違うものを採用されている可能性もありますので使用するメーカーの解説を確認してください。また、Ligationされる末端のモル数ベースで考えるというやり方もあります。λDNA-Hind IIIにはそういう末端がもとのλDNAのモル数よりたくさんあるのは明白です。あと文献検索など調査もしてみてください。特に自身の実験に近いものを見つけれるとやりやすいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9015-8 - 2020/07/15 (水) 09:05:35 - 中年 ligaseの単位の定義は次のようなものなので、条件が違うとはいえ数百ユニットでお釣りが来ると思います。 「6 μg/20 μlのλDNA-Hind III分解物を、16℃で約30分間に90％以上ライゲーションさせる酵素活性を1 Uとする。」 最適な反応容量は難しいところですが、現実問題として数百μl程度で良いのではないでしょうか。コンカテマーの形成がどのくらい問題になるかによりけりでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.9015-7 - 2020/07/15 (水) 09:01:27 - おお まずUnitの定義を見てください。それから最低必要量が算出できます。

(無題) 削除/引用 No.9015-6 - 2020/07/15 (水) 08:43:50 - あお ありがとうございます。 あまり経験はないのですが、以前使ったことのあるプロトコルは遺伝子工学実験ノートに記載されていたのを改変したプロトコルです。 インサートDNA20ngでT4 ligase 0.5μl 合計液量が5μlの計で、 今回環状化したいと思っているDNAが500ng/μl x 50μl＝25μgで、すべてのDNAの環状化にそのままの計をあてはめるととんでもないことになりそうだ…と思ってしまった次第です。 今回は自己環状化を目的としているのですが、 たとえば25μgのDNAを自己環状化するのに、酵素の量(unit)とバッファー液量(ml)の計はどのくらいあれば可能と考えられますでしょうか。 これまで経験されたプロトコルなどをご教示いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9015-5 - 2020/07/15 (水) 02:05:45 - おお 単発の実験でなくしばらくじゃんじゃん使うなら遺伝子を取ってきてリコンビナントを作る手もあるといえばあるけど。

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