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(無題) 削除/引用 No.9014-4 - 2020/08/04 (火) 09:55:07 - お仕事ご苦労様です マウスの膵臓って超ちっちゃいし、脂肪組織に埋もれて結構これ探しにくい気がするんだが、間違えて脂肪組織と取ってきたということはないね。白濁が脂質関連のものだとしたらと-----と危惧したので。

(無題) 削除/引用 No.9014-3 - 2020/08/02 (日) 12:57:15 - トリプシン >[Re:2] お仕事ご苦労様ですさんは書きました : > 分野が全然違う素人ですが素人なりの見解として、膵臓組織内に普段あるのは活性のあるTrypsinではなくて前駆体のTrypsinogenと高校の時に生物で習いました。十二指腸に分泌されてから腸のエンテロぺプチダーゼで限定分解受けて活性型（つまりTrypsin）になると大学に入った後の生物学の講義でに習いました。なので、assayの過程で、Trypsinogenを活性化させてTrypsinにするようなステップがなければ、活性は測れないのではないでしょうか。そうしたステップはassay kitのプロトコルにありますか。 > 膵炎とかじゃなくて健康な人や動物の膵臓組織であの様なものが元気に働いているというのは素人的には普通ちょっとありえないような気がして。あくまで曖昧な記憶と適当な想像なのであまり当てにしないでください。 ご返信ありがとうございます。 背に腹は代えられないと思い目的の手法に近い有料論文を取り寄せ、確認してみたところ、ご指摘通りエンテロペプチダーゼ処理を行っておりました。キットにはエンテロペプチダーゼ処理については記されておらず、ホモジナイズした際に出てくる細胞内プロテアーゼ等によって活性化されるのかと勝手に思ってしまっておりました。もっともキットのプロトコールには個別の組織ではなく、大まかな組織サンプルを用いた場合の方法としてざっくりとした書き方がされていたため、そのまま書かれた通りにせず、組織ごとの適切な処理方法についてもよく考えるべきでした。 白濁自体については解決できておりませんが、（エンテロペプチダーゼが高価であったため）十二指腸抽出物と混ぜることによって発色が見られ、発色による吸光度が濁りによる吸光度よりも十分大きいため、濁りはブランクとして引くことで実験を成り立たせることができました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9014-2 - 2020/07/24 (金) 23:42:00 - お仕事ご苦労様です 分野が全然違う素人ですが素人なりの見解として、膵臓組織内に普段あるのは活性のあるTrypsinではなくて前駆体のTrypsinogenと高校の時に生物で習いました。十二指腸に分泌されてから腸のエンテロぺプチダーゼで限定分解受けて活性型（つまりTrypsin）になると大学に入った後の生物学の講義でに習いました。なので、assayの過程で、Trypsinogenを活性化させてTrypsinにするようなステップがなければ、活性は測れないのではないでしょうか。そうしたステップはassay kitのプロトコルにありますか。 膵炎とかじゃなくて健康な人や動物の膵臓組織であの様なものが元気に働いているというのは素人的には普通ちょっとありえないような気がして。あくまで曖昧な記憶と適当な想像なのであまり当てにしないでください。

膵臓酵素活性測定について 削除/引用 No.9014-1 - 2020/07/14 (火) 17:46:39 - トリプシン いつもお世話になっております。 膵臓の酵素活性を測定するために、トリプシン活性測定キットを購入しました（BioVisionのTrypsin Activity Colorimetric Assay Kitというものです）。 付属のトリプシンを用いて手順通りに基質と混ぜるとしっかり（黄色に）発色しました。しかし、マウスから膵臓を取ってきてホモジナイズして遠心後得た上清を用いて、同様に基質と混ぜると白濁してしまいました。黄色い発色も見られず、トラブルシューティングを見ても基本的な手順のミスについてしか記載されておらず原因は分からないままです。また、手順書には膵臓抽出物を用いて測定した結果も記載されており、可能ではあるみたいです。 具体的な手順としましては、マウスから取ってきた膵臓を0.2g程度1.5mlチューブに移し、0.2mlのassay bufferを加えてペッスルでホモジナイズし、遠心後（1500rpm,15min,4℃）の上清をサンプルとしました。このサンプルを3倍から9倍まで段階的に希釈し、各々50μｌプレートに移し、手順書通りassay bufferで25倍希釈した基質液を50μｌ加えて、経時的な吸光度を測定しました。 混ぜた瞬間に白濁が見られ、吸光度の値から白濁度合いは経時的に増加していました。また、サンプルの濃度に比例して白濁も濃くなっています。 商品サイトに記載されているキットを用いた論文についても見てみたのですが、オープンアクセスのものは膵臓を用いた場合の具体的な手順は記されておらず、閲覧料を払うまではできずという状態です。 もし酵素活性測定についてご経験等ございましたら何卒宜しくお願い致します。

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