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(無題) 削除/引用 No.9003-13 - 2020/07/10 (金) 23:30:18 - おお >抽出バッファーはTris-HCl pH 7.4, CHAPS, Triton X-100, EDTAが含まれているのですが、 濃度の問題はあるにしろ通常蛋白を抽出するようなバッファー組成なら泳動されないということはないです。 >これまでも動物細胞からタンパク質を抽出していたのですが、イオン交換や透析など このときのイオン交換など精製ステップに入る前の細胞のLysatesの作り方は？ >動物細胞から とおっしゃいますが培養細胞ですか？それとも動物の組織を使ったのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9003-12 - 2020/07/10 (金) 20:24:14 - 1q２w３重４r５t６y７右８位９ CBB染色の場合、10μg/laneなら余裕でたくさんバンド見える。1μ/laneでも主要なものは見える。培養細胞からタンパク質を抽出すると見た目よりも意外と取れないことが多い。細胞数と抽出液の液量にもよるので断定的なことは言えないけど、2mg/mlのタンパク質溶液を得るのには可溶化溶液の容量を少なくしてかつ、かなりの量の細胞が必要と思う。タンパク質定量の後の計算間違ってないかな？桁とか希釈率とか。小数点とか。

(無題) 削除/引用 No.9003-11 - 2020/07/10 (金) 19:50:56 - み >[Re:9] tkさんは書きました : > BSAは100 ugを同様にSDS-bufferで調製して泳動しました。なので濃すぎたためかバンドがすごく濃く見えました。 1レーンに精製蛋白BSAを100ugも流せるゲルってどんだけ幅広いレーンなんだろ。 流しすぎで隣のサンプルに悪影響及ぼしそうだわ。 ミニゲルなら2,3ugでもCBBで検出できる。 でかいレーンを使用しているのなら10ugは少ないのかもしれない。 それと抽出後、遠心して上清回収するくらいしたら良いのに。 Tx,CHAPS,EDTAの濃度くらい書いて欲しい。 横着だな。

(無題) 削除/引用 No.9003-10 - 2020/07/10 (金) 18:45:03 - tk 皆さんあまり界面活性剤に触れられていないということは、やはりバッファーには問題ないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9003-9 - 2020/07/10 (金) 18:43:54 - tk おおお様 逆でした。申し訳ありません。 2回泳動をしたのですが、2回とも抽出液（ライセート）でのみバンドが確認できなかったので、おそらくほかに要因があるのかなと... TS様 BSAは100 ugを同様にSDS-bufferで調製して泳動しました。なので濃すぎたためかバンドがすごく濃く見えました。

(無題) 削除/引用 No.9003-8 - 2020/07/10 (金) 18:17:13 - TS ポジコンのBSAをLysis bufferで同じように溶かして、サンプルバッファーに混ぜて泳動したらどうなりますか。 超音波で破砕していてタンパク濃度も十分にあるようなら、何らかの原因でゲルに入っていっていないのではないかと思うのですが。 それと、ポジコンのBSAはどのくらい流していて、どの程度のバンドが見えるのでしょう。CBBの感度はどうかなと。

(無題) 削除/引用 No.9003-7 - 2020/07/10 (金) 16:54:49 - おおお 660で測定されているなら、問題ないですね。 抽出液と5×バッファー量は逆で、抽出液が20 uLでしょうか。 トータル10 ug以上なら、さすがにうっすらとでも何かしら見えそうですが。もしあればOrioleとか銀染色とか感度のいい染色されると見えてくるかもしれませんね。 後は、ゲルトップで引っかかって、ゲルに入っていないというのは大丈夫でしょうか？ 抽出というと遠心などして細胞から取り出すという印象がありまして。破砕液そのままなら抽出(extract)ではなくライセートかなあと。この辺りは言葉の定義なので置いておくとして、どのくらいの細胞数で破砕されているかわかりませんが、自分の場合は1×10^6程度の細胞数に100 uLの溶解液を入れてバスソニケーターにかけてます。溶液量が多いと、TCA 沈殿するのが面倒なので。

(無題) 削除/引用 No.9003-6 - 2020/07/10 (金) 16:34:02 - tk おおお様 >>超音波破砕で抽出しというのは、抽出液をいれて懸濁した細胞を破砕し、そのままサンプルバッファーと混合して流したということですか？ その通りです。 具体的には2 mg/mlの抽出液5 ulを5×SDS buffer 20 ulと混合し、その内10 ulをゲルにアプライしています。 タンパク濃度はPierce reagentを使っていますので、660 nmで測定しています。 >>自分ならバスソニケーター使って細胞膜破砕して 抽出バッファーを入れずにということでしょうか？勉強不足で申し訳ありませんが、液体中で超音波破砕機を使うのが効率が良いと思っているのですが、どうでしょうか...

(無題) 削除/引用 No.9003-5 - 2020/07/10 (金) 16:20:02 - おおお ごめんなさい、BSAアッセイでなくBCAアッセイですね。タイポしてました。

(無題) 削除/引用 No.9003-4 - 2020/07/10 (金) 16:18:07 - おおお 超音波破砕で抽出しというのは、抽出液をいれて懸濁した細胞を破砕し、そのままサンプルバッファーと混合して流したということですか？ タンパク質濃度はBSAアッセイでの定量でしょうか？Tritonは280 nmの吸収持ちますので、UVだと正確に測れません。 抽出液を何 uLアプライしたかの情報が欲しいですね。 トータルタンパク流すなら、自分ならバスソニケーター使って細胞膜破砕して、抽出などせずにトータルライセートにしてからサンプルバッファーと混ぜますが。

(無題) 削除/引用 No.9003-3 - 2020/07/10 (金) 16:05:50 - tk M様 CBB染色で可視化しています。 これまでも動物細胞からタンパク質を抽出していたのですが、イオン交換や透析などを行ってからSDS-PAGEを行っていました。なので違いというと、サンプルのバッファーがEDTAや界面活性剤を含むかどうか程度です。 ポジコンとしてはBSAを直接SDS-bufferで還元・加熱したものを同時に泳動しました。そちらはバンドが確認できたので、ゲルや泳動層、SDS-bufferに問題はないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.9003-2 - 2020/07/10 (金) 15:52:04 - M タンパク質は、どのような方法で可視化しようとしているのでしょう？ 今までやっていたタンパク質の実験と、今回の実験の違いは、動物細胞からの抽出タンパクを使っている点だけでしょうか？ ポジコンはありますか？

SDS-PAGEがうまくいかない 削除/引用 No.9003-1 - 2020/07/10 (金) 15:44:50 - tk タンパク質のSDS-PAGEについて質問させていただきます。 動物細胞からタンパク質を超音波破砕で抽出し、その抽出液をそのまま（精製等をしないで）SDS-PAGEで確認したいと思っています。抽出液（タンパク濃度2 mg/ml）に4×SDS-bufferを加え過熱し、SDS-PAGEで泳動してみたのですが、全くタンパク質が見えません。 抽出バッファーはTris-HCl pH 7.4, CHAPS, Triton X-100, EDTAが含まれているのですが、何か原因となるような箇所はありますでしょうか？ これまでタンパク質実験を行っていたので、SDS-PAGEのテクニック的な部分は問題ないかと思っています。個人的には、サンプルにCHAPSやTriton X-100などの界面活性剤が含まれていることかなと考えているのですが、結論には至っていません。 皆様、宜しくお願いします。

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