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アルカリ法によるプラスミドの精製がおかしい トピック削除
No.8993-TOPIC - 2020/07/09 (木) 11:36:01 - RAO
お世話になっております。いつもお世話になっております。
アルカリ法を使ったプラスミド精製法(Megaprep)を以前から行っているのですが、最近、上手く取れなくなってしまいました。CMV-eGFPのプラスミドなのですが最終的に濃縮した抽出液ではNanoDropで測定するとDNA濃度はそれなりに含まれていますが、細胞株にトランスフェクションしても全く蛍光が見られず、発現しません。
ほぼキットのプロトコル通りに行っていて、若干異なるところと言えば、アルカリ化→中和反応を行って、そのあとの凝集物を取り除くための遠心のGを高めて、遠心時間を4℃でプロトコル＋10分程度長めにしていることくらいです。遠心した後の上清が以前はこんなに濁っていたっけ？？と思うほど濁っています。

中和反応の時間が長すぎたり、温度が低すぎたりした場合、プラスミドの変性が起こってしまったり、析出したりすることはあり得ますか？

原理的にはアルカリ化してから中和反応するまでの時間は大事な気がしますが、中和してしまった後からの時間というのはあまり関係ないような気がするのですが…。他に原因があるのかな？とも思っています。

ご教示お願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.8993-4 - 2020/07/09 (木) 16:01:51 - G25
念の為申し添えますが、制限酵素消化していない、精製したプラスミドそのものも必ず泳動してください。

・ccc vs OC, linearの比率でintactnessを評価でき、ひいては精製過程の問題の有無が予想できる。
・制限酵素消化するとゲノムDNAのコンタミが細断化されて見えなくなる。

>中和反応の時間が長すぎたり、温度が低すぎたりした場合、プラスミドの変性が起こってしまったり、析出したりすることはあり得ますか？

原理的にもないし、それで問題が起こった経験もないです。


>そのあとの凝集物を取り除くための遠心のGを高めて、遠心時間を4℃でプロトコル＋10分程度長めにしていることくらいです。遠心した後の上清が以前はこんなに濁っていたっけ？？と思うほど濁っています。

濁るのはおかしいし、以前はそうでなかったのならなおあやしい。

それとは直接関係ないが、よく知られているテクニカルチップで、

中和塩析のステップでいわゆるsoln 3に加えて、少量（ミニプレップなら（１，２滴くらい）のクロロフォルムを入れると、析出物が壁面についたりふわふわ浮かんだりせずに、底部のクロロフォルム界面でしっかりパックされる。

(無題) 削除/引用
No.8993-3 - 2020/07/09 (木) 15:18:42 - おお
まずどのキットをお使いですかね。

一つの方法論として、TRITON X-114を使ってLPSを除去するやり方があります。その場合温度は大事です。この辺はキットが何かなど情報がないと判断がしにくいです。


精製したプラスミドは一度インサートが入っていると分かるような制限酵素などを使って切断した上で電気泳動で確認してください。指摘にもありますがUVでの定量ではRNAの量で左右されますし、精製したプラスミドが何らかの理由で目的のものではなかったりする事も場合によっては起こりうるので。

(無題) 削除/引用
No.8993-2 - 2020/07/09 (木) 12:02:23 - G25
まず、泳動してチェックしましょう。
吸光度だけでは、定性的な情報がありません。
泳動の時、比色で量が見積もれるマーカーも用意。
吸光度はRNAやゲノムDNAのコンタミで上底されているかも。

アルカリ法によるプラスミドの精製がおかしい 削除/引用
No.8993-1 - 2020/07/09 (木) 11:36:01 - RAO
お世話になっております。いつもお世話になっております。
アルカリ法を使ったプラスミド精製法(Megaprep)を以前から行っているのですが、最近、上手く取れなくなってしまいました。CMV-eGFPのプラスミドなのですが最終的に濃縮した抽出液ではNanoDropで測定するとDNA濃度はそれなりに含まれていますが、細胞株にトランスフェクションしても全く蛍光が見られず、発現しません。
ほぼキットのプロトコル通りに行っていて、若干異なるところと言えば、アルカリ化→中和反応を行って、そのあとの凝集物を取り除くための遠心のGを高めて、遠心時間を4℃でプロトコル＋10分程度長めにしていることくらいです。遠心した後の上清が以前はこんなに濁っていたっけ？？と思うほど濁っています。

中和反応の時間が長すぎたり、温度が低すぎたりした場合、プラスミドの変性が起こってしまったり、析出したりすることはあり得ますか？

原理的にはアルカリ化してから中和反応するまでの時間は大事な気がしますが、中和してしまった後からの時間というのはあまり関係ないような気がするのですが…。他に原因があるのかな？とも思っています。

ご教示お願いいたします。
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