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(無題) 削除/引用 No.8990-10 - 2020/07/08 (水) 13:18:25 - G25 ちなみにAlkali lysisで使う試薬で、いちばんshelf life が短いのはいわゆるSoln 2, Alkali/SDS 溶液です。時間とともに空気中の二酸化炭素で中和されてきて溶菌が不十分になったりするようだ。キットはそのへんごまかしているけれど（力価が下がることを見越して予めちょっと濃い目にしてあったりする製品もあるようだ。新品を使うと変性プラスミドが生じやすかったりする経験から）、自前でやるプロトコールでは要時調製が基本。

(無題) 削除/引用 No.8990-9 - 2020/07/08 (水) 13:09:22 - G25 キットを疑うなら、キットを使わずコンベンショナルなAlkali/SDS　methodを試してみればいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.8990-8 - 2020/07/08 (水) 12:57:31 - 真琴 ちなみに、15ml tubeに5mlってすごい量ですね。私はいつも2mlしか入れていないんですが、どうやってシェイクしてますか? *ちなみに、5/15mlを今回の収量低下の原因と疑っているわけではなくて, 10ugも取れるなら真似してみたいと思いました。

(無題) 削除/引用 No.8990-7 - 2020/07/08 (水) 12:55:21 - 真琴 mini prepキットを試しに別のものを使ってみては？ 同じ会社のキットを使っていて、同様の収量低下を経験したので、そのときはキットのせいにしました。

(無題) 削除/引用 No.8990-6 - 2020/07/08 (水) 12:32:37 - G25 ファージの汚染がラボに蔓延している。 まさかと思うけど、ない話じゃない。しばしば、汚染されたラボの噂を聞く。 ファージ耐性の宿主も市販されているので、乗せ換えてみる？

(無題) 削除/引用 No.8990-5 - 2020/07/08 (水) 11:57:34 - 一知半解 まずはカラムの問題かどうかを切り分けるために、カラムに掛ける前のlysateをエタノール沈殿して、収量を確認してみては？ （また、15mLのチューブに培地を5mLというのは、大腸菌の培養にしてはエアレーションが悪すぎだと思います。今回の問題はそのせいではないようですが。）

(無題) 削除/引用 No.8990-4 - 2020/07/08 (水) 11:52:21 - AA >>pc6.2バックボーンのGFP発現プラスミドでもストックを作ったとき からキットは新しくされたりしていますか？ 以前、学生にミニプレップをさせたら全然取れなかったことがあり、 学生の実験ということで手技を疑って何度もやり直させていたらキットを使い切ってしまい、 キットを新しくした途端に取れるようになったことがありました。 バッファーなのかカラムなのか不明なままでしたが経験談ということでご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.8990-3 - 2020/07/08 (水) 11:35:48 - ミニプレップ 原因を探るため変えたのは LBプレートの作り直し 抗生物質ストック（アンピシリン）作り直し 培養用液体LB培地作り直し TB培地で培養してみる プラスミドをエタノール沈殿し、形質転換からやり直し 自作コンピテントセル（DH5a）作り直し 購入したコンピテントセル（TOP10）を使用して形質転換 mini prepキットの試薬を使いかけから新品に変更 エアレーションの問題を考えて50 mLチューブに15 mLのLB培地で培養 いずれも大腸菌量などは問題なく、収量だけが1/10程度という状況は改善されませんでした。 理研BRCのサイトも参考にさせていただいていますが、該当するものではないようです https://dna.brc.riken.jp/ja/manual/manual_05 また自作プラスミドではなく、購入して保存しておいたpc6.2バックボーンのGFP発現プラスミドでもストックを作ったときの1/10程度しか収量がなく、最早手詰まりです。 1種類だけなら普段の10倍量培養して力業で解決できますが、今後も何10種類とプラスミドが必要になるので、なんとか原因を究明して改善したいと考えています。 同じようにmini prepでのプラスミド収量が急に悪くなった方、この問題を解決できた方がいらっしゃいましたら、情報共有お願いできませんでしょうか。 どうぞよろしくお願いいたします。 長くて投稿不可でしたので、3レスになり申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.8990-2 - 2020/07/08 (水) 11:33:02 - ミニプレップ 使用しているバックボーンはpcDNA3.1もしくはpcDNA3.3です。 mini prepキットは日本ジェネティクスのものを使用しています。 各種培地作製レシピはsigmaの冊子に準じています https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipeecoli.pdf 過去には以下のような例を見つけましたが、この方はコントロールは収量に問題ないようで、私の例とは異なるようです。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;start=6;Code=2137

ミニプレップスケールでのプラスミド収量低下 削除/引用 No.8990-1 - 2020/07/08 (水) 11:31:33 - ミニプレップ お世話になっております、年間に50-100コンストラクトくらい作るポスドクです。 コロナの自粛明けで実験を再開したところですが、mini prepでのプラスミドの収量が、試した10種類のプラスミドのいずれも、今まで取れていた量の1/10ほどになってしまいました。大腸菌量は目視ではありますが特にこれまでとは変わらず、プレート上でもコロニーは生えますし、toxicなものを発現しているわけでもありません。 これまではLBプレート上のコロニーをピックアップして、15 mLチューブに5 mLのLB培地で37℃オーバーナイト培養（12-14時間程度）し、10-15 ug程度とれていましたが、ここ何週間か1 ug程度しか取れなくなってしまっています。

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