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(無題) 削除/引用 No.8990-30 - 2020/08/12 (水) 01:32:19 - ミニプレップ 大分時間がかかってしまいましたが、ようやく解決できました。 おそらく原因は2つで、1つはアンピシリンの劣化、もう1つはLB培地の劣化でした。 こちらで作製したグリセロールストックを他施設に送って液体培養を試してもらったのですが、全く増えなかったことからアンピシリンを疑って、新しい試薬を購入しました。 新しい試薬で作製したLB/Ampプレートにグリセロールストックをストリークすると、全くコロニー形成せず、今までのシングルコロニーはほぼプラスミドを保持しないものだったようです。 新しくグリセロールストックを作り直して他施設に送り、今度は液体培養でも問題なく増え、半分を送り返してもらい、ミニプレップしたところほぼ同収量が得られたので、キットや手技の問題では無さそうだとなりました。 ただ、こちらでグリセロールストックから液体培養を行った場合、収量が他施設でやった時の1/3程度にとどまりました。 LB培地も相当古いので、新たに購入しました。 現在は新しい培地で5 mL培養で10 ug程度の収量をコンスタントに取れるまでに回復しました(pcDNA)。 アンピシリンもLB培地も、使うのがほぼ自分だけなこともあり、おそらく10年以上前に購入されたものを使い続けていたのが原因と考えられます。数ヶ月使っていなかっただけでこんなに劣化するのかという疑問もありますが、他施設にも協力してもらい、必要量が確保できるようになったので、ここで解決とさせていただきます。 ご助言いただいたみなさま、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8990-29 - 2020/07/09 (木) 23:38:32 - ミニプレップ >G25さん 詳しい情報ありがとうございます、T1とT5ファージが問題なのですね。勉強になります。 >おおさん 近隣には大腸菌扱っているところがないので、他施設の研究者にお願いして培養液送って試してみたいと思います。ありがとうございます。 さすがにレンジはないですね。オートクレーブしております。

(無題) 削除/引用 No.8990-28 - 2020/07/09 (木) 15:07:46 - おお ＞液体培養中にプラスミドを落としてしまうかどうかの確認ということでしょうか。試してみます。 精製の段階は大丈夫という判断なら。 もし他のラボで大腸菌からプラスミドとっているようなら、Miniprepのときの培養を　Duplicateしてもらって、片方を自身で精製してもう一方はそのラボで精製してもらって（というかするだろうから）、収量を比較してみるといいかもしれません。それなら精製過程は問題なしとはっきりとするわけで、プレート上で問題がなければ培養過程と完全に絞れますから。 培地はオートクレーブして作ってますか？最近はレンジでOKというやり方もある程度広まっているようですが。ファージ関連ではレンジでは心細いという話を聞いたことがあるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.8990-27 - 2020/07/09 (木) 14:43:15 - G25 >私が用いているDH5aはT1ファージには耐性のようですが、 そうだったんですね。ならばファージ原因説のセンはなさそうです。 世界的にラボで問題になるのはT1あるいはT5などで、T1耐性宿主でコントロールできるはずですし、市販のファージ耐性宿主でそれ以外を見た記憶がないです。

(無題) 削除/引用 No.8990-26 - 2020/07/09 (木) 13:34:14 - ミニプレップ >おおさん ありがとうございます。コロニーを大きくしてから根こそぎ取るというのは、プレート上では問題ないが、液体培養中にプラスミドを落としてしまうかどうかの確認ということでしょうか。試してみます。 >G25さん ファージ耐性のホストを使われて解決されたのですね、ありがとうございます。 私が用いているDH5aはT1ファージには耐性のようですが、ファージが原因だとすれば、違うファージの影響やもしれませんね。 よろしければG25さんが導入されたホスト株をご教示いただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.8990-25 - 2020/07/09 (木) 12:43:04 - G25 > よろしければどのように解決されたかご教示いただけませんでしょうか。 先にも書いたように、ファージ耐性のホストを導入しました。

(無題) 削除/引用 No.8990-24 - 2020/07/09 (木) 10:40:48 - おお >[Re:17] G25さんは書きました : > > 重量換算だとプラスミドサイズ（分子量）でもちろん変わるわけだが、LBであれば1.5 mLカルチャーから 10 ug以上というのはove- estimateだとおもう。 それぐらいは取れると言う話は聞いてはいますが。確かにインサートなしのpUCとかそういうプラスミド使ったみたいなチャンピオンデーターみたいなものだとは思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.8990-23 - 2020/07/09 (木) 10:37:24 - おお プレートのコロニーを直径２ミリぐらいまで増やして根こそぎとって簡易ミニプレップ（Sol I, II, III, エタ沈）してみるとどうかな。５００ナノから１マイクロぐらむ程度は取れるでしょうからInsertの確認ぐらいはできます。そこで収量が落ちなければそれ以降のプロセスが問題とも言えるでしょう。ただ経験か、うまく行っている系との比較がないと判断しにくいですが。

(無題) 削除/引用 No.8990-22 - 2020/07/08 (水) 19:43:11 - ミニプレップ ちなみに、大腸菌内にプラスミドはきちんと保持されているなら、ミニプレップがうまくいかない1番の原因はP2の溶菌とN3の中和のところですね。キアゲンのキットだとLyseBlueという試薬が付いていて、溶菌がうまくいけば青く綺麗に染まり、中和がうまくいけばまた白に戻るというものです。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3739 学生さんにプラスミドが取れないと言われた時は、まずこのステップを疑います。LyseBlueを加えてもらって、ここをクリアできれば、今のところプラスミドが取れなかった例はないですね。 今回はミニプレップの手技というよりは、大腸菌は増えるのにプラスミドがうまく保持されていないか、保持されていないものが増えてしまったかのどちらかのように思っています。

(無題) 削除/引用 No.8990-21 - 2020/07/08 (水) 19:20:39 - ミニプレップ >G25さん スレッドの3レス目に書いた以下のサイトですね >理研BRCのサイトも参考にさせていただいていますが、該当するものではないようです https://dna.brc.riken.jp/ja/manual/manual_05 「もとのＤＮＡにファージでも混入しているのでは？そういう理由で、形質転換してすぐの大腸菌コロニーは得られても、それから培養を重ねた菌は育たないのでは、」 という記述があり、コロニー形成しても液体培養で増えないというパターンのようです。 > 最初のうちは、なんだか調子悪いな、くらいにしか思わなかったりする。 G25さんはファージ感染してしまったご経験があるのですね。よろしければどのように解決されたかご教示いただけませんでしょうか。私の場合は菌の増えも特に問題ないので、ファージかどうかはわかりませんが、もしファージならここでなんとか解決したいと思っています。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.8990-20 - 2020/07/08 (水) 18:12:34 - G25 >>ありがとうございます。ファージ汚染の話、何か文献などご存知でしたら教えていただけないでしょうか。理研BRCでもファージの話が書かれておりましたが、こちらとは異なり大腸菌は問題なく増えるので、関係ないかと思い、スルーしておりました。。 理研BRCの記述の内容を知りませんけれど、全くコロニーが生えなくなるとか、全く液体培養で濁度が上がらないとかではないので最初のうちは、なんだか調子悪いな、くらいにしか思わなかったりする。

(無題) 削除/引用 No.8990-19 - 2020/07/08 (水) 15:21:48 - ミニプレップ >pIHCさん ありがとうございます。アンピシリンストックの作り直しはしてみて、プレートなどは特にサテライトもなく問題は無さそうなのですが、確かに元の試薬はそれなりに古いので、新しく購入してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.8990-18 - 2020/07/08 (水) 14:57:14 - pIHC 一度アンピシリンを新しくするか、隣のラボから貰った物を試してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8990-17 - 2020/07/08 (水) 13:45:48 - G25 経験上、 TBは同じ体積のLBに比べて定常期の菌量、そこから取れるプラスミド量は5倍くらいになる。 重量換算だとプラスミドサイズ（分子量）でもちろん変わるわけだが、LBであれば1.5 mLカルチャーから 10 ug以上というのはove- estimateだとおもう。

(無題) 削除/引用 No.8990-16 - 2020/07/08 (水) 13:35:29 - ミニプレップ >一知半解さん 温度はかなり重要ですよね。以前温度センサーがいかれて温度が上がりすぎて菌が増えなかった経験があり、毎回ハンディ温度計を必ずインキュベーター内に入れて培養しています。少なくとも開始時と回収時は37度を示していました。

(無題) 削除/引用 No.8990-15 - 2020/07/08 (水) 13:31:10 - 一知半解 インキュベーターの温度が低いということはありませんか。pUC系のプラスミドは培養温度が高くなるにつてコピー数が上がるので。

(無題) 削除/引用 No.8990-14 - 2020/07/08 (水) 13:29:23 - ミニプレップ ちなみにコンストラクト作製の際は、2 mLチューブに700 uL程度のTB培地を入れてコロニーピックアップしてオーバーナイトカルチャーし、そのまま遠心してミニプレップします。 ハイコピーのものは数 ugとれますので、シーケンスに持っていきます。 おそらく今の状態で同じことをやれば、数10 ngしか取れないのだろうなと思います。。

(無題) 削除/引用 No.8990-13 - 2020/07/08 (水) 13:24:13 - ミニプレップ >真琴さん ありがとうございます。同じキットを別施設に送ってそちらの研究者に使ってもらいましたが、そちらでは問題なくワークしたと情報をいただきました。 15 mLチューブをジップロックに入れて、真横にしてシェーカーの網のところで固定してガシャガシャ振っています。コロナ禍前までは全く問題無かったのですが。。 >G25さん ありがとうございます。いろいろな検討の結果、今はキットは疑っていませんで、プラスミド自体か培養に何か問題があるのではと考えています。

(無題) 削除/引用 No.8990-12 - 2020/07/08 (水) 13:21:34 - 一知半解 収量に関しては、pUC系のプラスミドならば1.5 mLのovernight cultureから10 ug以上は取れると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.8990-11 - 2020/07/08 (水) 13:18:50 - ミニプレップ >AAさん ありがとうございます。キットごと変えてしまうのも手ですね。 > 一知半解さん ありがとうございます。早速サンプルを２つに分けて、Favogeneの空カラムと日本ジェネティクス純正カラムで試してみましたが、ほとんど同じ収量でした。 カラムの問題ではないようです。 >G25さん ありがとうございます。ファージ汚染の話、何か文献などご存知でしたら教えていただけないでしょうか。理研BRCでもファージの話が書かれておりましたが、こちらとは異なり大腸菌は問題なく増えるので、関係ないかと思い、スルーしておりました。。

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