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120度で抗原賦活化する方法 トピック削除
No.8985-TOPIC - 2020/07/07 (火) 07:07:14 - pIHC
皆さまこの度はお世話になります。

Thermoからヒト組織への抗体を購入しました。
その抗体はパラフィン包埋組織を1 mM EDTA in 10 mM Tris (pH8.5)中で120˚C, 3 min加熱する必要があるとのことでした。

私はこの抗原賦活化法は行なったことがありません。
大変稚拙な質問で恐縮ですが、120度で加熱する方法が思い浮かびません。
皆さまはどのようにされていますでしょうか？

1 mM EDTA in 10 mM Tris (pH8.5)を組織スライドに垂らし、そのスライドを電子レンジに入れ3分加熱をしてみましたが、温度もわからないですし、結果は何も染色されませんでした。

溶液中で120˚C, 3 min加熱する抗原賦活化法の具体的な操作法をシェアしていただけませんでしょうか？
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.8985-18 - 2020/07/11 (土) 07:18:03 - pIHC
AA様、
ガラス容器が割れてしまうことがあるんですね。
ありがとうございます。全く意識しておりませんでした。
外側に大きめの耐熱性タッパーを置くことにします。

また、オートクレーブの工夫のに関してありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.8985-17 - 2020/07/10 (金) 17:40:45 - AA
ガラスドーゼは割とよく割れますので、オートクレーブに入れる際には更にビーカーなどに入れてバッファーが窯の中に落ちないようにするといいと思います。


昔学生の頃に病理学実習ではじめに見せられたのが同じ抗体染色でもオートクレーブと電子レンジで染まり方が違う、というものでしたが、抗原賦活の条件はやはり大事です。
ただ、120度と書いてあるから必ずそれでなければいけないかというとそうではありません。
オートクレーブがない環境だったためにいろいろ検討して121度3分の条件を80-90度30分で置き換えられることを見つけていた知り合いもいます。
一回沸かした電気ポット内でドーゼごと湯煎状態にして時間を測る、という非常にシンプルなやり方で感心した記憶があります。

もちろん、特定の抗体、組織の組み合わせの話で、一般論ではありませんのでご留意ください。

(無題) 削除/引用
No.8985-16 - 2020/07/10 (金) 14:37:12 - pIHC
まっくろん様、bさま、z様

引き続きコメントをお寄せくださり、ありがとうございます。

やはり圧力鍋は条件検討が必要なのですね..
今は急ぎの染色を行なっているので、他の人の迷惑にならないように気をつけながらまずはオートクレーブでしのいでみます。

容器はガラス製のスライドホルダーの中にバッファーを満たし（50mlほど）オートクレーブをかけています。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.8985-15 - 2020/07/10 (金) 12:26:24 - ｚ
>[Re:5] AAさんは書きました :

> 私は、120度の時間を3分に設定する、という意味だろうと解釈してそのようにしてますが、皆さんはどうされていますか？


120℃を1分とか3分とかの設定にしてやっています。
高温の時間が持続されるので、15分とかのプロトコルもこれでいけるんじゃないかとか思うこともしばしば。
検証する気もないのでそのままでやってますが。


>[Re:6] pIHCさんは書きました :

> 初期設定は20分なので、なんとか3分でオートクレーブが止まる様な設定をしなくてはいけませんが、説明書を探すところから始めてみます。ありがとうございます。


120℃になって3分たったら本体のスイッチOFFで温度下がるまで置いておけばいいんじゃないかな。

(無題) 削除/引用
No.8985-14 - 2020/07/09 (木) 14:22:42 - 　b
切片に垂らしたくらいだと電子レンジしたら蒸発してしまいませんか。通常は50mlくらいの溶液にスライドグラス 沈めて電子レンジしてます。まず沸騰させて、それからスライドグラス 入れて、また沸騰させてながら五分くらいです。そのあとは冷めるまで室温放置します。

(無題) 削除/引用
No.8985-13 - 2020/07/08 (水) 03:17:31 - まっくろん
　お問い合わせの件について、前者で行っていますが、サンプルが少ない時などはもったいないなと感じることもあります(バッファー自体のコストはそれほど高くはなく、圧力鍋も小さいものなので、しれてはいますが)。知り合いで1) 圧力鍋に水をはる、2)バッファーを入れた容器を圧力鍋の中に入れ、沸騰するまで加温3) スライドを立てたラックを容器に入れて加圧・賦活化、ってやってる人がいます。こちらはやったことがありませんが、問題なくできると言ってました。圧力鍋を使用する場合は条件検討をされると思いますので、合わせて検討されてはどうかと思います。

(無題) 削除/引用
No.8985-12 - 2020/07/07 (火) 21:51:39 - pIHC
PD様
水をちょろちょろ掛けるとすぐに変形しそうな気もしましたが、そんなことはなさそうですね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.8985-11 - 2020/07/07 (火) 21:48:23 - pIHC
マックロン様
ありがとうございます。
家庭用圧力鍋、早速教授に頼んでみます。

まっくろん様はどのようにスライドを鍋内に置かれていますか？
並々とEDTAバッファーを注ぎ、スライドラックにスライドを立てて行うか、
それとも高圧耐性の容器？にバッファーを少量入れ、スライドを寝かせて行われていますか？もしよければ教えていただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用
No.8985-10 - 2020/07/07 (火) 16:31:36 - PD
圧力なべでやると、圧力が上がってから３分→流しでちょろちょろ水をかけて水冷で急激に温度を下げることができます。

(無題) 削除/引用
No.8985-9 - 2020/07/07 (火) 15:16:50 - まっくろん
　うちはT-falの家庭用圧力鍋でやってます。IHコンロも合わせて2-3万円で手配できますので，興味がおありであれば検討されたらいかがかと思います。オートクレーブよりは，かなり使いやすいです。

(無題) 削除/引用
No.8985-8 - 2020/07/07 (火) 13:43:36 - pIHC
名無し様

ありがとうございます。
おっしゃる通りです。きちんと考えながら物事を進めてみようと思いました。

電子レンジで出ないものが圧力鍋やオートクレーブで出るようになるのか懐疑的だったのですが、ここで質問させていただいて、意欲が出ました。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.8985-7 - 2020/07/07 (火) 13:21:11 - 名無し
初歩的という以前に常圧下の水の沸点は100℃だろう。
モル沸点上昇で120℃までになるとは思えないだろ。
電子レンジだからどうという話ではない。
圧力鍋とオートクレーブはこの場合同義なんだけど分かってるのかなあ。

(無題) 削除/引用
No.8985-6 - 2020/07/07 (火) 11:41:05 - pIHC
皆さま
ご回答いただき、ありがとうございます。
ヒトの組織サンプルは購入したもので肝臓組織になります。

抗体購入会社に問い合わせをしたところ、圧力鍋とのことでしたが、やはり電子レンジではだめということを皆さまから学びました。

大変初歩的な質問をしてしまい、恐縮しています。

オートクレーブも浮かんだのですが、3分はどうしたらいいのだろうかと思い悩み、電子レンジを試しました。
ですが、早速オートクレーブを試してみたいと思います。

皆さま、重ねてお礼を申し上げます。

初期設定は20分なので、なんとか3分でオートクレーブが止まる様な設定をしなくてはいけませんが、説明書を探すところから始めてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.8985-5 - 2020/07/07 (火) 10:05:51 - AA
120度はオートクレーブで間違いないと思います。

ちなみに横道にそれてしまいますが、オートクレーブは仕組み上3分経過後すぐに開けられないのでダラダラと加熱しダラダラと放熱することになります。
私は、120度の時間を3分に設定する、という意味だろうと解釈してそのようにしてますが、皆さんはどうされていますか？

オートクレーブです 削除/引用
No.8985-4 - 2020/07/07 (火) 09:44:24 - ema
https://m-hub.jp/biology/1785/89

https://ruo.mbl.co.jp/bio/support/method/immunohistochemistry.html

ネットでも紙の本でも多く情報が出ています。

(無題) 削除/引用
No.8985-3 - 2020/07/07 (火) 09:43:13 - 縞々
それが分からない人がヒト検体を扱っちゃダメです。
指導者の指示に従ってください。

(無題) 削除/引用
No.8985-2 - 2020/07/07 (火) 09:16:56 - z
オートクレーブだよねとは思うんだけど

先に本とか読んだほうがいいんじゃないかなとも思うし

どうしたらいいかな

120度で抗原賦活化する方法 削除/引用
No.8985-1 - 2020/07/07 (火) 07:07:14 - pIHC
皆さまこの度はお世話になります。

Thermoからヒト組織への抗体を購入しました。
その抗体はパラフィン包埋組織を1 mM EDTA in 10 mM Tris (pH8.5)中で120˚C, 3 min加熱する必要があるとのことでした。

私はこの抗原賦活化法は行なったことがありません。
大変稚拙な質問で恐縮ですが、120度で加熱する方法が思い浮かびません。
皆さまはどのようにされていますでしょうか？

1 mM EDTA in 10 mM Tris (pH8.5)を組織スライドに垂らし、そのスライドを電子レンジに入れ3分加熱をしてみましたが、温度もわからないですし、結果は何も染色されませんでした。

溶液中で120˚C, 3 min加熱する抗原賦活化法の具体的な操作法をシェアしていただけませんでしょうか？
よろしくお願いいたします。
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