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レンチウイルス感染での安定発現細胞作製について トピック削除
No.8972-TOPIC - 2020/07/01 (水) 06:07:43 - 安定発現細胞
レンチウイルス感染での安定発現細胞作製についてご意見を聞かせてください。

レンチウイルスを用いてあるタンパク質を安定に発現する細胞を作製したいです。
ウイルス感染細胞はピューロマイシン抵抗性となります。
事実、そのような細胞が樹立されました。

皆さまはここから細胞のクローニングを行われますでしょうか？
目的にも寄るかもしれませんが、ウイルス感染によってピューロマイシン抵抗性が獲得された以上、全ての細胞において目的のタンパク質は発現しているという前提が保たれますでしょうか？

なぜ疑問に思ったかというと、昔pcDNA3を293Tに一過性発現させ、その後、G418を加えて出来てきたコロニーをピックし、タンパク質を発現しているクローンを単離していました。

レンチウイルスの場合にはそのような操作は必要ないでしょうか？
ご意見聞かせていただけますと幸いです。
　
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No.8972-5 - 2020/07/01 (水) 13:24:39 - 安定発現細胞
みなさま、書き込みをありがとうございます。

bicistronic promoterで遺伝子が発現しますのでIRESとは違いリスクはあるかもしれませんが、LTRで挟まれた領域にその2つの発現ユニットがあるのでまずはバルクで解析を行ってみます。

みなさまのご意見を聞かせていただき、とても参考になりました。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.8972-4 - 2020/07/01 (水) 11:55:18 - mp
マーカーがIRES下流にあれば、ほぼ全ての細胞が発現していると考えていいです。ただし物によってはIRESの影響で発現が低いものもあり注意が必要ですし、正確を期するなら免疫染色などで発現populationを確認すべきでしょう。おそらく並列プロモーターでも似たようなものだと思います。レンチを使うメリットの一つはバルクで解析できることです。クローニングするとそれだけ選択がかかってしまうので、例えばempty vectorとの比較などでは、複数クローンを解析する必要が出てきます。
もちろん実験の目的にもよりますし、もし発現がより高いものが欲しいなどの場合は、クローニングも選択肢に入ってくるかと思います。

(無題) 削除/引用
No.8972-3 - 2020/07/01 (水) 11:01:48 - asan

レンチウイルスによる安定発現
＞レンチウイルスの原理によってゲノムにインテグレートされるので耐性＝通常ほぼ100%ウイルス感染。

リポフェクション等による一過性発現による安定発現
＞DNA上のホモロジーなどによるランダムインテグレーション
＞目的のDNAの発現を伴う組み替えかどうかは不明、効率が非常に悪い


この2つの違いを考える必要があります。
シングル化すべきかどうかは実験の目的などにもよりますからどちらが正解不正解というものではないと思います。
ただ、後者の方法では耐性となったもののでも発現してないものは結構見えます。

(無題) 削除/引用
No.8972-2 - 2020/07/01 (水) 10:50:46 - 独り言
実験によります。
レンチやレトロで安定発現株を作れば、大抵は発現細胞なので、そのまま使っても大丈夫です。すべての細胞で発現しているかまでは保証できません。あくまでpuromycin耐性遺伝子が発現しているというだけで、目的遺伝子が別のプロモーターである場合は、そっちだけゲノム効果などにより発現がかなり低い場合がります。

ただ、トランスフェクションによる薬剤選択に比べたら、クローンを単離しなくてもかなり発現してます。

なので、自分の実験系がレンチでクローン化しなくてもよいのであれば、それでよいでしょう。クリーン化するとクローン差などの細胞差がでてきますし。

レンチウイルス感染での安定発現細胞作製について 削除/引用
No.8972-1 - 2020/07/01 (水) 06:07:43 - 安定発現細胞
レンチウイルス感染での安定発現細胞作製についてご意見を聞かせてください。

レンチウイルスを用いてあるタンパク質を安定に発現する細胞を作製したいです。
ウイルス感染細胞はピューロマイシン抵抗性となります。
事実、そのような細胞が樹立されました。

皆さまはここから細胞のクローニングを行われますでしょうか？
目的にも寄るかもしれませんが、ウイルス感染によってピューロマイシン抵抗性が獲得された以上、全ての細胞において目的のタンパク質は発現しているという前提が保たれますでしょうか？

なぜ疑問に思ったかというと、昔pcDNA3を293Tに一過性発現させ、その後、G418を加えて出来てきたコロニーをピックし、タンパク質を発現しているクローンを単離していました。

レンチウイルスの場合にはそのような操作は必要ないでしょうか？
ご意見聞かせていただけますと幸いです。
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