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(無題) 削除/引用 No.8971-3 - 2020/07/01 (水) 17:00:58 - うに 確認実験ではちゃんと青色コロニーが確かに生えるのに、白色コロニーが生える現象から考えれば、セルフライゲーションではなく、なにか断片を咥えこんでいるのは確実でしょう。 >今回ゲルでの抽出の過程を経ているため何らかの短い断片が混入したとも考えずらいのではと個人的に考えています。 完璧であるとは断言できない。混入を減らすことはできてもゼロには出来ないと思います（たとえば、ゲルの中でフラグメントが通過したあとでも一部は吸着して残っている可能性がある（それを防ぐために予め合成オリゴヌクレオチドやキャリアtRNAなんかをプレランしてブロックするという方法をなにかのプロトコールで読んだことがある）。 それは微量なのかもしれないけれど、本丸（目的のPCR産物）が入る効率が著しく下がっているようだと、雑魚が入ったものばかりということになるでしょう。 効率を下げdそうなポイントをいくつか挙げると、 ・UV照射。DNA断片分子のどこか一箇所でもピリミジンダイマーができると死にますから、的が大きい分、長い分子ほど死にやすい。 ・PCRサイクルの過剰。新規合成の効率よりPCR産物の解離再会合する割合が増えてくると、かっちり対合した完璧な二重鎖が減ってくる？ ・PCR反応後の処理。PCR反応終了後、長時間放置していないか（プログラムの最終ステップを4℃、無期限にしたりして）。 平滑ライゲーションということは校正活性のある酵素系だろうけど、そういう酵素は基質（dNTP)が枯渇してくるとexonuclease活性で3'末端から削り込みを起こし、3'陥没末端にしてしまう。反応終了後、速やかに酵素を失活させる処理を。

(無題) 削除/引用 No.8971-2 - 2020/06/30 (火) 14:00:46 - おお それはイメージしているセルフライゲーションではないからでしょう。小さなフラグメントが挿入されていたり、end-joining repair時に変異が入るからのように思えます。そもそもBAP処理で単純に大腸菌内でもつなげることができませんから。

BAP・Hinc�U処理プラスミドによる青白選択 削除/引用 No.8971-1 - 2020/06/30 (火) 11:48:49 - ペペロンチーノ リン酸化プライマーにより増幅した平滑末端の600bp程度の断片（電気泳動後ゲルから抽出済み）をBAP処理したHinc�U切断puC118に挿入し、青白セレクションでコロニーをピックアップしました。すると生えてきたコロニーがすべて白色でした。そのため適当なコロニーからプラスミドを採取し目的断片の挿入をPCRで確認しましたが、プライマーとMCSの長さの断片が得られ目的断片は入っていませんでした。 今回、TakaraのHinc�U・BAP処理済みpuC118 vectorとMighty Ligation Mixを使っていますが、BAP処理は100％の効率でないらしく、それなりの確率でセルフライゲーションしたものが混じり青いコロニーも生えてくるようです。そのため当初は培地中のX-galやIPTGの劣化を考え、JM109株の野生株を培地の確認として播種しましたが、青いコロニーが生え培地がワークしていることが確認できました。 なぜ、培地もきちんとワークしているのにセルフライゲーションしたと思われるコロニーが白色で生えてきたのでしょうか。今回ゲルでの抽出の過程を経ているため何らかの短い断片が混入したとも考えずらいのではと個人的に考えています。どなたかご教示頂ければ幸いです。

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