BioTechnicalフォーラム [変異導入の方法について。]

変異導入の方法について。

No.8964-TOPIC - 2020/06/27 (土) 06:56:29 - 変異導入

いつも拝見させてもらっています。
私は3.5kbのinsertの入ったpcDNA3.1+に、変異を導入しようとしています。

この一週間、inverse PCRにて1アミノ酸導入を試みましたが、作製したい4つの変異体のうち、1つしか完成できませんでした。4つのうち2つにおいてKOD FX Neoを使ったPCRはかかっています（10 ngの鋳型DNAを元に20サイクルPCR反応）。残り2つはPCRすらかかりませんでした。他の酵素 (PfuやPrimeSTAR)も使用しましたが、結果は同様でした。

inverse PCRに代わる変異導入法として、変異を中央に持たせたプライマーのセンス鎖、アンチセンス鎖を用意し、ポリメラーゼで全周を合成する方法があるかと思いますが、原理は全く違うものですが、試す価値ありでしょうか。

inverse PCRがうまくいかなかったことがこれまでになかったので途方に暮れています。
増幅はされているようなのですが...
　

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No.8964-4 - 2020/06/27 (土) 22:30:53 - Nanasi

個人的な経験ですが、
「全長に渡って完全に相補的」なセンスとアンチセンスのprimer setよりも
5’端側15bだけで相補的で、3’端側は20bくらいhang overにしてtemplate と結合し易い様にした方が成功率が高いです。変異は15bの中に入れてもhangover の5’寄りでもどちらでも構いません。
プライマーが長くなるので、いつも脱塩グレードにして値段を抑えてます。
この方法にしてから成功率が上がる事を考えればプライマー代なんて微々たるものです。

(無題)

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No.8964-3 - 2020/06/27 (土) 11:05:47 - toto

inversePCRのときに、変異箇所の外側に２０塩基くらいの相補的な配列を両端に作っておいて、それでself-assemblyをInFusionかNEBuilderで行うという方法ですよね？それでとれないときはほとんどtemplateの混入ですが、それならＤｐｎ処理で解決できます。　inverse PCRが増えないときはだいたいアニールの温度を変えれば解決できますが、どうしてもだめならprimerの配列を少し変えます。KOD Oneに変えたらうまくいったという事もありました。KOD Oneでは逆にだめな事もありましたが。

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No.8964-2 - 2020/06/27 (土) 07:42:30 - おお

すでに変異をいれたプライマーがあると思うので、そのプライマーとベクター内のプライマー（ｐCDNA３とかだとT7とかT3、CMV上とかPolyA付加シグナルあたりにプライマーが設定されていると思う）でPCRしてPCRフラグメントを電気泳動などで精製して、そのフラグメントと最初のPCRと反対側のベクター内プライマーを使って増幅して全長をつくり、適切な制限酵素できってべくたーに入れるという方法もあります。

PCRフラグメントはプライマーよりはるかに長いですが、プライマーとして機能します。もしきになるならPCRフラグメントと反対側プライマーで１０回ぐらいPCRしてDnpI処理後PCRフラグメント増幅で使ったプライマーと反対側のプライマーで再増幅すればいいでしょう。

http://cshprotocols.cshlp.org/content/2019/6/pdb.prot097824.abstract

方法論にはバリエーションもあると思いますのでご自身でも探してみるといいかもしれません。

変異導入の方法について。

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No.8964-1 - 2020/06/27 (土) 06:56:29 - 変異導入

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