Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

iPCR後の処理に関しまして。 トピック削除
No.8951-TOPIC - 2020/06/24 (水) 08:14:23 - iPCR
iPCR後の処理に関し、質問させてください。

プロトコルではiPCR後、ゲルから切り出し精製を行い、その後にCutSmart buffer中でDpn1処理を1時間、ATPとDTTを加えたのちPNK処理を1時間し、最後にligaseを加えると書かれてありました。

今はプロトコル通りDpn1とPNKを順に行なっていますが、時間短縮の目的のため、切り出し精製を行なったのち、CutSmart, ATP, DTT, Dpn1, PNKを全て入れても可能ではないかなと思いました。
先生方はどのように行われているかコメントをいただけたら幸いです。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.8951-7 - 2020/06/25 (木) 02:04:19 - iPCR
おお先生

ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.8951-6 - 2020/06/24 (水) 11:11:15 - おお
>PNK処理とligationは同時で行なっていたりしますか？

わたしは最近していないので、、、ただ、やっているという話は聞くことはあります。
ブランとで低温で長期のほうがベターなのは知ってますが、まあInsertを入れるわけではなく自己閉環させるならあまりLigation効率を考える必要もないのかもしれません。

Ligation酵素とバッファーが別になっているなら、PNK後に酵素を追加すればいいわけだし、状況に合わせて臨機応変にやればいいかと思います。

(無題) 削除/引用
No.8951-5 - 2020/06/24 (水) 10:53:24 - おお
>ゲル抽出後にDpn1処理し、再度ゲル抽出

PCR後にサンプルを希釈とか、エタ沈、カラム精製とかしてDpn1処理して電気泳動すると２度電気泳動するのは避けれます。

Dpn1処理すればプラスミドはばらばらになるのでたしかにそんなに気にすることはないとも言えます。少し活性が弱ってたりしてAmpとOriがあれば大腸菌で増えてくるだろうし、細かく切れたフラグメントがPCRで増やしたプラスミドにInsertされているクローンが交じる可能性など、確率的に多くはないだろうけど避けるほうがスッキリするかなというのが私の方法論の理由です。質問された方法論が間違っているというわけでもないので、ご自身で実験環境その他も考慮の上判断されるといいかと思います

(無題) 削除/引用
No.8951-4 - 2020/06/24 (水) 09:20:47 - iPCR
おお先生、ご教示いただき、ありがとうございます。

Dpn1後に電気泳動をした方が良かったのですね。
私はPCR後に泳動を行い、増幅ができたことを確認しつつ、ゲル抽出を行う流れが私の中でありましたので、ゲル抽出後にDpn1処理し、再度ゲル抽出は考えもしませんでした。Dpn1による断片化は木っ端微塵のイメージですので、スピンカラムでも代用できそうな気がしますね。ありがとうございます。

おお先生はPNK処理とligationは同時で行なっていたりしますか？
もちろんblunt endの場合は低温で長時間となるとPNKとは条件が違って来てしまいますが。
後学までに教えていただけたら幸いです。

(無題) 削除/引用
No.8951-3 - 2020/06/24 (水) 08:39:37 - おお
手順的にはDpn I処理してから電気泳動したほうがDpn I 断片が混じらないのでベターだと思います。

(無題) 削除/引用
No.8951-2 - 2020/06/24 (水) 08:31:29 - おお
https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/activity-of-dna-modifying-enzymes-in-cutsmart-buffer

iPCR後の処理に関しまして。 削除/引用
No.8951-1 - 2020/06/24 (水) 08:14:23 - iPCR
iPCR後の処理に関し、質問させてください。

プロトコルではiPCR後、ゲルから切り出し精製を行い、その後にCutSmart buffer中でDpn1処理を1時間、ATPとDTTを加えたのちPNK処理を1時間し、最後にligaseを加えると書かれてありました。

今はプロトコル通りDpn1とPNKを順に行なっていますが、時間短縮の目的のため、切り出し精製を行なったのち、CutSmart, ATP, DTT, Dpn1, PNKを全て入れても可能ではないかなと思いました。
先生方はどのように行われているかコメントをいただけたら幸いです。
全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。