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(無題) 削除/引用 No.8942-5 - 2020/06/23 (火) 07:05:27 - れんちん みなさんと意見は同じですが、シンプルに流れをまとめると、 エレポ後にG418で選択。 その際、すぐにシングルセルにしようとはせずに、数週間はG418入れっぱなしで培養されてはいかがでしょうか。 数週間後、細胞が増えてくるでしょうから、その数は死細胞を凌駕しているはずですし、それからシングルセルにすればよいかと思います。 最近は、という表現をすると適切ではないかもしれませんが、安定発現細胞を作製されたいのであれば、私もレンチウイルスで遺伝子導入する案に賛成です。圧倒的に効果的です。

(無題) 削除/引用 No.8942-4 - 2020/06/22 (月) 21:10:27 - mp 周りに死細胞がいても問題ないです。気持ちが悪ければficollを使って除くとか。あとは死細胞除去できるビーズなどもあります。

(無題) 削除/引用 No.8942-3 - 2020/06/22 (月) 16:59:54 - asan そもそもバルクの状態でG418でセレクションをかけてるのだから確実に増えてる細胞集団になってからシングル化すればいいだけの話だと思います。この場合シングル化する目的は単なるランダムインテグレーションによる耐性クローンを覗くことが主な理由になると思います。 FACS sorterが身近にあるならば96 well ソーティングでシングルにしてもいいですけどね。その場合はG418じゃなくてGFPとかでやる場合が多いのかな。 単に安定発現株を作るだけならば、浮遊細胞はウイルス使った方が楽だし早いと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.8942-2 - 2020/06/22 (月) 12:26:05 - おお >遺伝子の導入効率が7%程度 それは一過性のものを含めてですか？もしそうならIntegrationされて増殖してくるのはその１０００分の１とか、、、 ある程度セレクションがかかってから生細胞ベースで撒きこむほうがいいのでは？ あるいはソフトアガーやCMCなどでコロニーを作らせるか。

浮遊細胞の薬剤選択/シングルセルクローニング 削除/引用 No.8942-1 - 2020/06/22 (月) 11:13:09 - 死細胞 いつも勉強させていただいております。 表題の通り、浮遊細胞（Raji細胞）での安定発現細胞樹立のためにエレクトロポレーションで核酸を導入後、G418で薬剤選択を行い、限界希釈法によりシングルセルクローニングを行おうと考えております。 しかしながら、接着細胞とは異なって、浮遊細胞では生/死細胞の分離が容易ではないため、薬剤選択後のシングルセルクローニングの進め方に悩んでおります。 遺伝子の導入効率が7%程度なので、大多数の死細胞が生じることが想定されますが、あくまで生細胞数を指標としてsingle cell/wellとなるように、死細胞を除去せずに播種してもよいものでしょうか？ このような死細胞大多数のサンプルでシングルセルクローニングを試みた方がいらっしゃいましたらご経験をご教示頂けますと幸いです。

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