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(無題) 削除/引用 No.8936-5 - 2020/06/18 (木) 16:47:59 - G25 配列によってそう現象が起こります。 ポリメラーゼの進行を阻む二次構造を生じるような配列があって、そこから先の伸長反応が急に進まなくなるんですね。GC-richとかGT-richな配列は要注意。 たしかにcccは理想的な鋳型ではないけれど、だめな配列はPCR断片のような完全線形の鋳型でも読めなかったりします。 よくある現象でもあり、対処法や対策用の製品なんかもあるので、調べてみては。二次構造を取りにくくするベタイン添加なんかもその一例。 供給元のアプライドバイオシステムズにもトラブルシューティングがあるはず。 PEG沈殿はこの問題になんの助けになりません。PEG沈殿の効果は、RNA分解物のような短ヌクレオチド鎖を除去すること。短ヌクレオチド鎖がプライマーになって、散発的なプライミングが起こるためにすべてのラダーですべての塩基種がポジティブになってしまったりするのを防ぐためです。サンガー法を Klenowでやっていたころは効果絶大でしたが、サイクルシークエンスになってからは別にRNAを除去しなくてもほとんど問題なくなりました。

(無題) 削除/引用 No.8936-4 - 2020/06/18 (木) 14:32:44 - asan シーケンスが読めない原因 https://www.eurofinsgenomics.jp/media/29305/seq%E3%83%88%E3%83%A9%E3%83%96%E3%83%AB%E3%82%B7%E3%83%A5%E3%83%BC%E3%83%86%E3%82%A3%E3%83%B3%E3%82%B02014oct.pdf

(無題) 削除/引用 No.8936-3 - 2020/06/18 (木) 14:08:35 - 初真 noname先生 ありがとうございます。 それは初耳でした。一度読めていないサンプルを使って試してみることにします。

(無題) 削除/引用 No.8936-2 - 2020/06/18 (木) 14:01:03 - noname 読みたい配列と関係ないところを制限酵素で切って直鎖状にすると読める確率は上がると思います。 プラスミドがscの状態を保っているとシーケンス反応中のポリメラーゼがDNAに取り付きにくくなって反応が進まないと聞いたことがあります。

シークエンスが300bpまでしか読めません。 削除/引用 No.8936-1 - 2020/06/18 (木) 13:53:23 - 初真 先生方、質問をさせてください。 私は形質転換した大腸菌コロニーを増やして2mlからミニプレップを行い、コンストラクトの確認をシークエンシングにより行いました。 ラボの他の方は700-800bpほどは読めているとのことですが、私の場合、150bp程度から突然ピークの大きさがガクンと下がり、300bpほどしか読めません。中には全く読めていないものすらあります。 教えてくださる先生からpcDNA3をお分けいただき、その配列は800bpまで読めました。 そこで私のサンプルがおかしいのではないかと考えています。 ちなみにシークエンスは学内の共通機器室の方がやってくださっております。 私は2mlの大腸菌液からミニプレップを行い、最後にTEで溶解したものを提出しています。 たまにベタインを入れると読める様になりましたと連絡をいただくこともあります。 PEG沈殿を行なったサンプルを提出すべきでしょうか？ 大変初歩的なことで恐縮ですが、よろしくお願いいたします。

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