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(無題) 削除/引用 No.8930-5 - 2020/06/18 (木) 22:04:49 - とら AA様 ご回答ありがとうございました。 Bufferは推奨のものを使用し、新しいものですし、他のプラスミドでは切断効率は十分高いので、温度やバッファーの問題ではなさそうな気がしています。 質問する前にもいろいろ調べたつもりでしたが、似たような症状(?)を呈している人を見つけました。 ttps://www.researchgate.net/post/What_is_this_extra_band_on_plasmid_gel アルカリ沈殿でプレップした際に、プラスミドが変性して、partly rerormed/partly random looped cccDNAとなってしまい、コントロールと別のバンドが出るそうですね。 やはりプラスミドの取り直しから始めた方がよさそうだと思いました。 addgeneから買った元のプラスミドからトラフォメし直していきます。

(無題) 削除/引用 No.8930-4 - 2020/06/18 (木) 10:44:20 - AA プラスミドの電気泳動については以下のThermoのページがわかりやすいです。 ttps://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/na-electrophoresis-education/na-electrophoresis-considerations.html XbaIやNotIで一晩切ってもマルチバンド、というのは流石におかしい気がします。 切断の条件(温度、バッファーなど)は大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8930-3 - 2020/06/18 (木) 00:35:22 - とら れんちん様 早速のご回答、ありがとうございます。プラスミドのシングルバンドがそもそもおかしいのですね。 お恥ずかしながら、まだプラスミドを数種類程度しか扱ったことがなく、先輩から引き継いだプラスミドの中にはシングルバンドのものもあったので、プラスミドの種類によってはシングルバンドしか出ないものもあるものかと勝手に思い込んでおりました。 プラスミド自体は精製してそんなに日がたっていないのですが、https://yeast.nig.ac.jp/yeast/pdf/CRISPRcas9Protocol.pdf ここを見ると、Cas9をもつプラスミドは不安定とのことでしたので、またプラスミドを取り直してみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.8930-2 - 2020/06/17 (水) 19:06:02 - れんちん 失礼なことかもしれませんが、未処理でシングルバンドもおかしいですし、消化しても複数バンドが出ているのも気になります。 プラスミドは新しいでしょうか？私ならもう一度プラスミドを取り直すところから始めますね。あとは、pX458以外のプラスミドがあれば並行して処理してみるといいかもしれませんね。

PX458をBbsIで消化した際のバンドについて 削除/引用 No.8930-1 - 2020/06/17 (水) 15:37:04 - とら いつも勉強させていただいております。 Zhang博士のPX458プラスミドを用いて、ある遺伝子のノックアウトを図ろうと考えています。 疑問は、PX458をBbsIで消化した際のバンドについてです。 PX458をBbsI（正確にはNEB社のBbsI-HF）で消化し電気泳動すると、未処置のプラスミドと比較して、高いバンド、同じ高さのバンド、やや低いバンドの3本が観察されました。 XbaIやNotIで消化すると、高いバンドと同じ高さのバンドしか観察されなかったので、 高いバンド　→　消化された１本鎖のバンド 同じ高さのバンド　→　未消化のバンド と考えましたが、残るやや低いバンドは何なんだろうと疑問です。 無処置ではシングルバンドなので、未消化の環状プラスミドのオープンサーキュラーとスーパーコイルの違い、というわけでもないのかと考えております。 star活性のことなども考え、incubate時間をあえてover nightともしてみましたが、バンドの数、濃度には変化はありませんでした。 もしかしたらものすごく恥ずかしい質問をしているのかもしれないという恐れもあるのですが、どなたかこの低いバンドの正体を教えていただけないでしょうか？

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