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(無題) 削除/引用 No.8920-10 - 2020/06/16 (火) 02:23:29 - おお > >おおさん > 細胞ライセートはすでに試しており、検出できている状況です。 ポジコンになるだろうから、組織から抽出したものと同時に流しなさいと言うことなんですが。 > β-Actin検出用のために新しくメンブレンを用意しましたが、検出できていない状況です。 > なので、ストリッピングはしていません。 じゃあ抽出条件も疑ったほうがいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8920-9 - 2020/06/15 (月) 20:46:08 - りょう みなさま、ご丁寧にコメントをいただき、ありがとうございます。 大変参考になります。 >おおさん 細胞ライセートはすでに試しており、検出できている状況です。 β-Actin検出用のために新しくメンブレンを用意しましたが、検出できていない状況です。 なので、ストリッピングはしていません。 >みさま 同時にCaspaseの検出もしているのですが、Cleavedは検出されるものの、Full Lengthが検出されないという現象が起こっています。 メンブレンのCBBでは、バンドははっきりと観察されていますので、他のタンパク量が多いのかもしれないですね、ありがとうございます。 >GGさま BCA Assayにて定量したのち、各レーン10ug程度ロードして泳動をしています。 はじめは濃度が低いのかと思いましたが、逆に40kDa付近のタンパクが多く、β-Actinが埋もれてしまっているということも考えられますね。 濃度を薄めて確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.8920-8 - 2020/06/15 (月) 20:21:02 - GG タンパク量はいくら載せてます？ オーバーブロットでバンドが白抜けしてしまっているとかでは。

(無題) 削除/引用 No.8920-7 - 2020/06/15 (月) 18:54:03 - み 他の組織や細胞なら検出できるというなら抗体や検出系は基本的に問題ないのかな。 消化管からのActin抽出効率が悪いか、含有率が低いか、抽出されていても分解が激しいか、エピトープ部分が限定分解されたか、Actinと同じサイズ40kDa付近で転写の邪魔をする他の蛋白含量が多いとか。 腸内のウンコさんはシゴイテ除去してから抽出していますか？ 除去してなかったら組織由来の蛋白が目減りする。 ムチンとかが多いと泳動乱れて（尾を引くような感じ）検出効率落ちるかも。 １０種類くらい組織をズラッと並べて発現プロファイルするとき、loading controlを示すけど、Actinでそろわないことアルアルな気がする。Muscleで多かったり膵臓で分解激しかったり。 そんな時はActin以外の蛋白を示している。

(無題) 削除/引用 No.8920-6 - 2020/06/15 (月) 16:58:00 - おお 蛋白抽出とかも気になるんだけどね。一度細胞のLysateを同時に流して見るのも手かもね。ストリッピングしているなら、ちょっと厳しすぎるのかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.8920-5 - 2020/06/15 (月) 15:14:10 - りょう >れんちんさま コメントありがとうございます。 メンブレンのCBB染色はしており、メンブレンへの転写が行われていることは確認済みです。 β-Actinだけでなく、GAPDHも観察できない状況です。

(無題) 削除/引用 No.8920-4 - 2020/06/15 (月) 14:53:06 - れんちん 他のハウスキーピングタンパク質ではどうですか？ GAPDHなどです。 あるいはポンソーSで染めて、すべてのレーンでアプライされてるタンパク質量が同じくらいかはわかりそうですね。

(無題) 削除/引用 No.8920-3 - 2020/06/15 (月) 14:27:18 - りょう ＞あおいさま 本件、ご回答いただきありがとうございます。 同じメンブレンにて検出ができない、という状況です。 ブロッキング液の検討、アジ化ナトリウムの可能性等は全て検証済みですが、それでも検出できない状況です...

(無題) 削除/引用 No.8920-2 - 2020/06/15 (月) 11:58:12 - あおい 他のサンプルがポジコンとして検出できているというのは、同じゲルにサンプルを流して、検出できるwell（他のサンプル）とできないwell（ラット消化管）が同じメンブレンで認められるという結果でしょうか？ 同じサンプルでcaspaseなどが検出されているのにb-actinが検出されないとなると、ストリッピングやブロッキングなど、検出に至るまでの手技の問題の印象ではありますが、同じメンブレンで検出できたりできなかったりということになると、タンパクの質の問題なのかもしれません。が、正直ちょっとわからないです。。 わたしも過去にb-actinがうまく検出できないことがありましたが、主な原因としてはブロッキング液の使い回し、オーバーブロッキング、あるいは１次抗体後のwashが甘く２次抗体のHRPがアジ化ナトリウムによって失活してしまった、などが原因と考えられました。

β-ActinのWB法について 削除/引用 No.8920-1 - 2020/06/15 (月) 10:01:11 - りょう 特定の組織サンプル（ラット消化管）にて、WB法によるβ-Actinの検出ができない現象が起こっています。 （他のサンプルをポジコンとして流した際には、検出ができていますので、実験フローには問題ないかと思っています。） β-Actinのようなタンパクであっても検出ができないサンプル、もしくは抗体との相性（現在はモノクローナルを使用）はあるのでしょうか？ なお、Caspaseのような他の因子は検出できています。

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