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(無題) 削除/引用 No.891-5 - 2012/09/03 (月) 19:08:15 - ~ >2mMチミジン4μl投与後 これは終濃度が2mMですよね。 培地が数mLあるところにuLオーダーで入れると終濃度がuMオーダーになってしまいます。 また、目的は何を得ることなのでしょうか？ ダブルチミジンブロックまではうまくいっているのであれば、そこからのリリース後の時間でコントロールすることで、同調したM期の細胞は得られるのではないでしょうか。 G2/M期でセルサイクルが止まったままの細胞や、リリース直後の細胞が必要なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.891-4 - 2012/09/03 (月) 13:30:59 - qq あなたの操作で、最初のPBS洗浄はThymidineを洗い去るためでしょうが、二度目のPBS洗浄は、１）ノコダゾールを洗い去るためですか、２）それともM期に入って丸くなった細胞を回収するためでしょうか？ ノコダゾール除去が目的だとすると、二度目のPBS洗浄では、M期の細胞を失う可能性がありますが、いかがでしょうか？ M期に入った細胞を回収するために、PBS洗浄するのであれば、PBSで洗浄した洗浄液を遠心してM期の細胞を回収して、ガラスボトムディッシュに植え込むのでしょうか？ ノコダゾールの問題よりも、別なところが少し不安です。

(無題) 削除/引用 No.891-3 - 2012/09/03 (月) 11:25:50 - のこのこ HeLaはノコダゾールだけで同調できると思います。 HeLaはまた、比較的強い細胞なのでノコダゾール洗浄でまた増殖し始めると思います。1-２割は死ぬかもしれませんが、全滅と言うことはなかったかと。それから推測すると、Thymidine 処理との組み合わせが悪いのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.891-2 - 2012/09/03 (月) 11:05:25 - おお この手の実験は、方法論が確立されている細胞以外では難しかったりします。お使いの細胞は細胞周期を薬剤でコントロールしにくい細胞の可能性はないですか。 細胞の状態にも左右される可能性もありますが、最悪の場合はマイコプラズマがいる場合もあるかもしれません。いまだにコンタミしたまま飼っているラボもおおいかもしれません。

M期同調　薬剤効果の検証 削除/引用 No.891-1 - 2012/09/03 (月) 10:16:10 - GT 未知の薬剤が細胞周期にどのような影響を与えるのか調べるためにM期同調させたいと考えています． 現在使っているのはHela細胞でdishは35mmです． 2mMチミジン4μl投与後24時間→PBSで2回洗浄後3時間培養→ノコダゾール(終濃度50ng/ml)投与後12時間→PBSで2回洗浄後，PLLコーティングしてあるガラスボトムディッシュに移し，DMSO2μl投与→観察 という方法で行ったところ，30%ほどがアポトーシスするため，ノコダゾールの毒性をできる限り抑えようとdouble-Thymidine brockをした後にノコダゾールを6hだけ作用させ，回収しました． しかしこの方法だと２〜3時間後に全滅してしまいます． 当たり前の結果なのかもしれませんが，生物の経験があまりなく頭を悩ませています． 何かアドバイスがあればお願いします． 普段の継代は問題なく行えています．

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