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(無題) 削除/引用 No.8898-14 - 2020/06/11 (木) 10:07:12 - qqq 他のラボに融通してもらうとか、業者にサンプル貰って間に合わせるんじゃ足りないか今後永続的にフィルターを使わず済ませる方法を探してるのかと思ったら違うんかい! 一時の間に合わせのためにメソッドをコロコロ変えるのはどうかと思うよ。

(無題) 削除/引用 No.8898-13 - 2020/06/11 (木) 08:15:41 - あー どの程度の遠心加速度及び時間なら特定の細胞を殺しきれるかなんて、試している人いないから具体的な回答など返ってこないだろうし、そこに試行錯誤の時間を割く事自体がもったいないので、僕なら最初から周りのラボ巡りしてなんとかフィルターを入手する。

(無題) 削除/引用 No.8898-12 - 2020/06/11 (木) 03:32:39 - 293T細胞 AA様、ありがとうございます。 パッケージング細胞である293T細胞からウイルス液を回収したのち、15000gで遠心して、なるべく293Tがコンタミしないように上清を静かに回収しています。 ただ、それでも一細胞でもコンタミしていれば、感染させたい細胞に持ち込まれることになるので、それをどう防ぐかを質問させていただきました。 フィルターを使わずにコンタミを防ぐ目的として、その後に超遠心で濃縮ということでしょうか？私は濃縮に成功した経験がないので、それならば他のラボからフィルターをお借りできないかと考え始めました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8898-11 - 2020/06/10 (水) 15:55:57 - AA フィルター処理しないで使うということは、トランスフェクションした細胞の培養上清をそのまま使ってるということでしょうか？ 先にコメントもありましたが、細胞とウイルスじゃ全然サイズが違うので遠心して細胞を落としてから濃縮遠心をすればだいぶ違ってきそうな気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.8898-10 - 2020/06/10 (水) 14:22:56 - 293T細胞 皆さまありがとうございます。 ウイルス液は凍結保存ではなく、プレップしたら速やかに使用しています。 実験目的はある遺伝子のノックアウトの癌細胞に、レスキュー実験でその遺伝子や変異体を戻すことによる表現型の回復度合いを見ることです。 そのノックアウトは増殖が非常に遅く、実は以前にも感染実験を行ったことがあり、GFPでソートしたにも関わらず293Tはコンタミしてきました。 おお様の仰るように293TそのものもGFPを恒常的に発現していたのかもしれません。 ラボの経済状況から、フィルター滅菌ができません。 フィルター滅菌をすればかならず293Tのコンタミが無くなることは長年の経験からわかっていますが、今回それをどうしても用いれないので、なんとかウイルス液から293Tのコンタミを無くしたいです。そのために高速での遠心によりコンタミした293Tを殺すことができないかを知りたく、トピを立てました。 ただ、15000gでも生き残るものはいそうな印象を持ちました。 皆さんはウイルス実験ではフィルター滅菌を必ずされているのでしょうか？ 私の場合、ノックアウトのクローンに感染させようとしているので、ソート後に更にクローニングは考えていません。バイアスをなくすためにバルクで行いたいです。

(無題) 削除/引用 No.8898-9 - 2020/06/10 (水) 11:30:15 - 774 γ線照射・マイトマイシン処理 でどうですか？

(無題) 削除/引用 No.8898-8 - 2020/06/10 (水) 09:51:03 - HHV そもそも293Tとウイルスで全然大きさ違うから、遠心分離して上清だけとればいいんじゃないの? なぜ細胞を殺す必要がある?

(無題) 削除/引用 No.8898-7 - 2020/06/10 (水) 09:39:23 - ちき マウスに注射するのでcell debrisの持ち込みを少なくしたいというような場合ならわかりますが、がん細胞株に感染させるのに少量(例えば0.1%)の293Tのコンタミが問題になるような実験って何がありますか。 もし長く継代したいなら、いずれにしろクローニングしたほうがいいでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.8898-6 - 2020/06/10 (水) 06:54:16 - おお >[Re:5] Mさんは書きました : > > 万が一、解凍後も増殖力を維持したGFP陽性293Tが混じったとしても、エピソーマルトランスフェクションなので、 みずからが産生したレンチが感染しているのでは？それならゲノムに組み込まれている。

(無題) 削除/引用 No.8898-5 - 2020/06/10 (水) 05:25:17 - M 15,000G 5minで293Tが死ぬかどうかは分かりません。少なくとも、超遠心で濃縮可能なウイルスはあまりダメージを受けないので、293Tも多少は生き残るかもしれませんね。 昨日調整したウイルス液は凍結保存ですよね？　そうであれば、293Tがコンタミしていたとしても凍結融解でダメージを受けるから、感染実験では増殖してこないかもしれません。 万が一、解凍後も増殖力を維持したGFP陽性293Tが混じったとしても、エピソーマルトランスフェクションなので、トランスファーベクターにSV40 oriが入ってなければ、細胞分裂で細胞が増加するに伴いGFPの発現は急速に減少すると予想されます。感染後、２週間くらい標的細胞を培養すれば、コンタミした293TのGFP発現は相当下がると思いますので、ソートでは問題にならないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.8898-4 - 2020/06/09 (火) 22:03:04 - 293T細胞 ありがとうございます。 感染後、GFP陽性細胞をソートします。その後、様々な細胞生物学的な実験に用いる予定で、感染効率は低く5%ほどです。 昨日15000g, 5minでプレップしたウイルス液を調製しました。 明日、293Tの継代時に予備実験してみるつもりです。

(無題) 削除/引用 No.8898-3 - 2020/06/09 (火) 10:35:16 - qqq > 10000g, 5分の遠心でまず間違いなくコンタミした293Tは死滅するでしょうか？ > 一細胞でもコンタミすればすぐに増えてくるとおもうので、やや不安があります… 試してみれば?簡単に試せるよね。 まずは実際の系の中でなくて293Tだけでで良いから。

(無題) 削除/引用 No.8898-2 - 2020/06/09 (火) 09:26:56 - ちき 遺伝子導入後、どのような実験を行うのでしょうか。そこに293Tが一細胞でもコンタミすれば問題があるような実験系ですか。また、薬剤選択やクローニングはしない前提でしょうか。

細胞ははどれだけの遠心力で死にますか？ 削除/引用 No.8898-1 - 2020/06/09 (火) 02:29:56 - 293T細胞 お世話になります。 現在実験で多くの変異体のプラスミドを構築しました。 今後、レンチウイルスを使い、目的の癌細胞に発現させたいのですが、普段は293Tでウイルスを作製したのち、0.02 micron のフィルターで滅菌したものにポリブレンを加えて感染実験をしています。 今回、経済的な状況から、フィルターを使わずにどうにかウイルス液にコンタミする293Tを排除できたらと思っています。 10000g, 5分の遠心でまず間違いなくコンタミした293Tは死滅するでしょうか？ 一細胞でもコンタミすればすぐに増えてくるとおもうので、やや不安があります… よろしくお願いします。

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