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(無題) 削除/引用 No.8882-13 - 2020/06/05 (金) 03:19:47 - おお >[Re:12] OKさんは書きました : > アドバイス参考になります。 > > CMV-GFP-Flag-ORFで作るということでしょうか。そして、GFPの前後とflagの前後にlox等を入れておいて後から抜くということですか？ > いや、Insertを入れるときに制限酵素で切ったとき、GFPが切り出せる制限酵素とFLAGが切り出せる制限酵素があるようなコンストラクトを作るということです。

(無題) 削除/引用 No.8882-12 - 2020/06/04 (木) 19:26:45 - OK アドバイス参考になります。 CMV-GFP-Flag-ORFで作るということでしょうか。そして、GFPの前後とflagの前後にlox等を入れておいて後から抜くということですか？ クローンを単離するのはかなり時間がかかりそうですね。調べた感じだと2か月ほどでしょうか。そうなると実験のターンオーバーがあまりよくなさそうですね。レンチだと感染率が高いので、プール細胞でやった方が逆にロット差が出ないですね。勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.8882-11 - 2020/06/04 (木) 17:33:25 - おお >[Re:6] OKさんは書きました : >FLAG等のショートタグをつけておいたもの1種類だけでいいのかなと思っているのですが、途中でGFP融合したものが欲しくなったりするものなのでしょうか？ どんな実験をしうるかでも変わってくるでしょう。 GFPとFLAGをタンデムに続けておけばConstructionのときの工夫でどちらか抜いたタグを入れることができますね。 >5株クローンを回収したとして、どれを実験に使用するのでしょうか？ ま、３つとって全てで同じ傾向かどうかを見るというのが一つのやり方だとおもいます。もう一つは導入した細胞株の過剰発現をshRNAなどで抑制して形質変化が戻るかどうか。過剰発現と同時に、KDの実験を並行して発現と見ている形質に相関があるかをみるなど方法論はいくつかあると思います。 ちょっと癌化に関しては形質が可逆的なのか、KDなどが有効な手段なのかという面で慎重な実験デザインをしたほうがいいかと思いますが。 クローンを拾わずPoolで実験するのも手だと思います。感染効率は高いと思いますが、それは使う細胞などにもよるのかもしれません。 EF1とCMVはそれぞれ細胞のタイプによって得てふえてがありますので、どちらも万能というわけではないようです。思いつきで勝手な事言うと、タンデムにつなげちゃえばどうだろう。

(無題) 削除/引用 No.8882-10 - 2020/06/03 (水) 08:59:04 - mp ちきさんがおっしゃるように、レンチのメリットはクローン化せずにヘテロな集団で扱えることが大きいと思う。クローン化するならプラスミドトランスフェクションでも良いわけで。もちろん挿入部位やコピー数が気になるのであれば、おっしゃられるような受託もありだと思いますが、バカ高いですよね（お金が有り余っているなら話は別です）。

(無題) 削除/引用 No.8882-9 - 2020/06/03 (水) 02:13:11 - OK 的確なアドバイスありがとうございます。 調べていたら、TrueSTABLE Cellという手法も見つけて、本当に厳密にやるならこういう方法も選択肢に入るなと考えていたところです。 厳密さを求めだすときりがないとなるとどこかで、一定のラインを引いて公正性を保つほかないですね。 なかなか奥の深い実験系ですね。よほど明らかな差異が出れば一目瞭然なのでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.8882-8 - 2020/06/03 (水) 00:25:02 - ちき レンチウイルスベクターに限りませんが、クローン依存性が気になるときは3クローンぐらい調べて同じような表現形ならよしとしていることが多いです。 逆にウイルスによる遺伝子導入の利点は、クローン化しなくても100%に近い導入体が得られることなので、そのまま実験に供することも極普通だと思います。クローン化不可能な細胞に用いることもある訳ですし。 無限にある実験条件のどれもが結果に影響するかも知れないと考え出したらきりがないです。ある程度は決め打ちにならざるを得ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.8882-7 - 2020/06/02 (火) 18:28:59 - AA 色んなバリエーションがあると、将来的にも実験が立てやすいのは事実ですが、 はじめは絞ってからでもいいのではないかと思います。 「あーGFP入れとけば良かった」 と思うこともあれば 「やっぱりGFPじゃまだなぁ」 ということもありますし、全部のせ一種類で解決！ということもないと思います。 いろんな種類を一度にたくさん作ると、プロモーターに問題があったなどの コンストラクト問題があると目も当てられません。 自分でパッケージングしても手間はかかりますし、受託で出したらコストで泣けます。 まずはシンプルなやつを1つか2つ試して見られるのが良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.8882-6 - 2020/06/02 (火) 17:05:57 - OK 御返信ありがとうございます。このあたりは教科書やキットの説明書だけでは分かりづらい経験則があるので非常に貴重なお話です。 ここで数人の方にお話しを伺っただけでも、バリエーションはそれなりにありそうですね。逆に言うと実験系ごとに作成したコンストラクトの比較はあまりしないので、どのケースで、どれがベストなのか絶対的なことが言えないということでしょうか。 追加で質問させていただきたく思います。 1.この質問は、実験プランによる！と言われそうなのであまりしたくないのですが、最初の段階で作成するコンストラクトは1種類だけにしていますか？現在は、ベクターにFLAG等のショートタグをつけておいたもの1種類だけでいいのかなと思っているのですが、途中でGFP融合したものが欲しくなったりするものなのでしょうか？ 2.ベクター構築、トランスフェクション、一過性発現確認、薬剤選択、安定発現クローンの選択という手順を踏む予定ですが、5株クローンを回収したとして、どれを実験に使用するのでしょうか？クローンのロット差は基本的にあるのでしょうか？正常細胞に遺伝子を導入して癌様のフェノタイプを表出させる予定です。場合によっては、最初に用いるトランスフェクション試薬やベクターの組み合わせ等も後々のフェノタイプに影響するものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8882-5 - 2020/06/02 (火) 10:27:59 - ちき 理研から昔購入したEFプロモーターのもの(original Fucciのbackbone)を培養細胞の安定発現株取得に使っていますが、困ったことはないです。選択マーカー無しですが、moiを高くできるような実験とか、感染後にクローニングするような実験では問題ありません。 脱線しますが、EFプロモーターって普通のプラスミドトランスフェクションで使った場合はうまく発現したことがないです(CMVに比べて)。そんなに例数やった訳ではないので、たまたまだと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.8882-4 - 2020/06/02 (火) 10:05:46 - 独り言 レンチウイルスよく使いますが、ベクターのウイルス構成因子をいじることはないです。 プロモーターは大抵CMVで、セレクションはPGKのPuromycinで基本的に発現させてます。なので、いつもトランスファープラスミドの発現遺伝子だけを入れ替えるだけで、いろいろなタンパク質の安定発現株を作成してます。 細胞はよくある癌細胞とかなので、それほどいろいろな細胞は使用してはおりません。 すごく長い遺伝子とか特殊な場合でない限り、発現が変になることは経験的にあまりないです。 例えば、CMV発現ならAddgeneでは https://www.addgene.org/19319/ とかよくつかわれているのでは。

(無題) 削除/引用 No.8882-3 - 2020/06/02 (火) 10:05:03 - mp Mさんがほぼ言い尽くされているので、若干付け足し。プロモーターでいうとだいたいEFで困ったことはなく、ほぼどんな細胞でも良く発現します。PGKは若干弱い印象です。CMVはEFと遜色ないですが、メチレーションを受けやすいことが言われています。vivoに戻す実験などでは注意が必要です。マーカーに関してはIRES Bsd, Neoなどを頻用していますが、ものによっては導入したい遺伝子の発現効率が下がることもあります。 市販のものは色々ありますが、RIKEN BRCから購入するのがコスト的にも良いかもしれません。ベクターもかなりの種類が揃っています。

(無題) 削除/引用 No.8882-2 - 2020/06/02 (火) 03:28:35 - M 私がレンチウイルスを使ってたのは、もう随分昔の事なので、今も使っている方からコメントがあれば、そちらを優先して下さい。専門の方からレスがつくと良いですね。 私見としては、 （１）プロモーターは、cDNA発現であればCMVIE、EF1a、 PGK、Ubc、CAGを使った事があります。Ubcを使ったベクターの発現が高かった記憶がありますが、同じベクターで全てのプロモーターを変えてテストしたわけではなく、標的細胞によっても変わってくると思うので、ゴールドスタンダードとは言えません。一般的にはCMVIEかEF1aかなと思うのですが、他の方のご意見も聞いてみた方が良いと思います。 マーカーの選択は、EGFPを使う事が多かったです。プロモーターを別個に入れるか、polycistronic（IRES、2Aなど）にするのか、融合タンパクにするのか、選択も色々ですから、こちらもゴールドスタンダードになるものはないと思います。 レンチの実験を始めた当初は、cPPTやWPREをいじったり、プロモーターを変えてみたり、試行錯誤した時期もありましたが、ある時期から決め打ちになりました。自分で開発するよりは、文献を見て良いベクターがあれば供与してもらう形になりました。今ならば、市販のバックボーンを決め打ちで使えば良いかと。 （２）インサートをタグ付き融合タンパクにしたら問題になるような場合はインサート自体の問題なので、心配ならウイルスベクターに組み込む前に通常の発現系でテストしておくと良いと思います。タイターが上がらないとか、感染効率が悪いとか、ウイルス自体の問題で行き詰まった場合は、ベクターをいじらないでもできる対応をやれるだけやってダメならベクターを変えるようにしてました。感染しにくい細胞が標的の場合は、文献などでどのようなベクターを使うか下調べをしておいた方が良いでしょう。 （３）お金があれば、受託するのが手っ取り早いと思います。

レンチウイルスベクターの作製 削除/引用 No.8882-1 - 2020/06/01 (月) 15:04:25 - OK レンチウイルスベクターのデザインを行っているのですが、周りに経験者がおらず、また調べてもどうしても分からない部分があるため、質問させていただきます。 1.ORFの前に使うプロモーター、抗生剤耐性遺伝子、MPRE後のマーカーの選択は、文献を参照しながら、また細胞腫の特性も考慮して決定すると理解しているのですが、最終的に、gold standardは存在するのでしょうか？それとも、これで上手く行っている人がいるからこれで行こうという決め打ちなのでしょうか？ 2.1とも関連するのですが、機能解析の際、ある実験では上手く行っても少し実験のタイプを変えると、上手く行かないということもありうると愚考しています(FLAG2タグをつけたら、ある実験では都合が悪かった、等)。実験の初期段階では想定できないことも十分起こると思うのですが、どこまで想定してデザインされていますか？行き詰まった際は、ベクターから再デザインでしょうか？ 3.近年は、レンチウイルスベクターはみなさん受託で依頼しているのですか？

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