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(無題) 削除/引用 No.8879-23 - 2020/06/03 (水) 09:33:00 - asan コツ 1. primerのTmをできるだけ近づける. 2. 完全に相補的なprimerにする必要はないので、3'側を5-10塩基ほど突出末端にする形で設計する。のりの部分は最低15塩基20塩基程度あれば通常は十分です。変異部分でも関係ない。 自分は設計アルゴリズムとか考えずに5>3で 15塩基＋変異＋20塩基というような形で40塩基程度ものを機械的に作ってます。これでdeletion含めてうまくいかなかったケースはほとんどないです。 3. Ta 50℃は低すぎるので55℃ぐらいでやる。増えなければ16cycleぐらいまでやってみるほうがいい。　鋳型の量は10-50 ng程度でいいと思う 100 ngは多すぎる印象があるし、それで増えるというものではない気はする。 4. 酵素の相性も結構あるので別の酵素を持ちる。KOD, KOD FXシリーズが個人的には好き。 DMSO, タッチダウンその他変わったこと苦し紛れにやっても効果的な経験はほぼないので、どうしてもうまくいかないなら配列との相性が悪いと諦めて別の方法をとったほうが早いことが多い。 オーバラップするプライマーをどうせ買ってるのだから、別々に増やして1つにしてさっさとクローニングしてしまうのも手です。金があるならgibsonとかin fusionで入れれば楽かも。

(無題) 削除/引用 No.8879-22 - 2020/06/03 (水) 07:05:42 - 住野 すみません、追記です。 今、最後の望みをかけてタッチダウンPCRをかけたところです。

(無題) 削除/引用 No.8879-21 - 2020/06/03 (水) 07:02:58 - 住野 みなさま、コメント、アドバイスをいただけたこと、重ねてお礼を申し上げます。 ありがとうございます。 はやる気持ちを抑え、早くからラボに来ましたがやはりプレートにはコロニーは生えていませんでした。 Dpn1がワークしているということだけはわかりました。 早速酵素を注文することにしました。 まずPrimeStarとKOD Fx Neo DNA Polymeraseを注文することにします。 それでもダメな時用に、NEBuilder Master Mixも注文します。 酵素を変えるというのは正直選択肢としてありませんでした。 なぜならプラスミドを鋳型に用いていますし、必ず増えるはずという考えがあったためです。 また、Pfu Ultra IIには馴染みがあり、また経済的な事情からそれ以外の酵素へ切り替える考えすらありませんでした。 しかし、多くの失敗を重ね時間と試薬をロスしていることから、私のとった選択肢は不適切だったと気づくことができました。また、NEB Builderやギブソンアッセンブリ、In-Fusionを勉強する機会にもなり、まず必要な材料を早く作り遅れを挽回したいと思います。 この度は大変多くのことを教えていただき、自分の未熟さ、不勉強さを自覚するとともに、力がみなぎってきました。みなさま、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8879-20 - 2020/06/02 (火) 15:31:31 - あ APさんは昔からけっこう適当な事言うし、指摘しても謝らないんで相手にしないほうがいいですよ

(無題) 削除/引用 No.8879-19 - 2020/06/02 (火) 12:47:08 - ななしあーる だいたい変異を入れようとしたら自動的にプライマーにする領域も決まってくるし、あまり設計の自由度なんかないから、慣れた人ならメーカーHPのプライマーデザインソフトなんか使わないと思うんですね。文面からもある程度予想できますが、変異を入れるのにわざわざAgilentのデザインを使ったことからAgilentのQuickChangeの方式でやろうとしてるのだろうと予測が付くんですね。初心者が他社のキットでやるときにわざわざAgilentのプライマーデザインサイトを使うのも、絶対ないとは言えないけど、素直にキットのプロトコルに従えばそうなるだろうし。 また、QuickChangeはPCRマシンを使ってサイクル反応をするので初心者がPCRと呼びたくなる気持ちも理解できるので、上記の理由と合わせて、「QuickChangeのシステムですかね？」と断定はせず、相手の言い足りてないところを引き出すつもりで確認をとったわけです。 ですので、「文脈から言って inverse PCR 法なのは明らかですね。」との断定的な言い方を見て自分も”人のふり見て我がふり直せ”と心に刻みました。

(無題) 削除/引用 No.8879-18 - 2020/06/02 (火) 09:49:19 - kks なんか盛り上がってる話題と全然違ってて恐縮なんですが、変異を入れる場所のプライマーのペアが問題そうなら、自分なら相性とか考えずにさっさと諦めてCDSの5'側と3'側で分けて変異を導入して、それらのフラグメントを繋げるプロセスを踏んで変異体発現ベクターを構築することを選ぶかも知れません。 初歩的(あるいは前時代的)な手法ですが確実なので、変にドツボにハマって足踏みするよりは良いかなと思うのですがどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8879-17 - 2020/06/02 (火) 08:21:49 - 住野 みなさん、たくさんのコメントをいただき、ありがとうございました。とても驚きました。本当に感謝しています...。 言葉足らずですみませんでした。 はい、QuickChange法を用いています。 ttps://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp はい、おっしゃる通りPCRではない、と過去のトピックで拝見しましたが、どうここで表現すべきかわからず、PCRと書いてしまいました。浅はかな考えで混乱を招き恐縮しております。 以前に同様な方法で変異導入がうまくいかず、ここの過去トピにあった、増幅をきちんと泳動で確かめるといい、とあったので、以降、増幅がみられるか泳動により確認し、確認できればDpn1処理を行うという流れで行っていました。iPCRとIn-Fusionを組み合わせた方法を取れるとは考えたこともありませんでした。 一度まず机上で考えてみます。ありがとうございます。 PrimeSTAR、評判いいみたいですね。一度いくつかの酵素を揃えて、試してみます。 私はPfu一択でしたので、こだわりが強すぎるのだなとここで知りました。 「増えて当たり前みたいな実験でなのに増えないってのは、やっぱりおかしい。」 そうおっしゃっていただけて、やはりプライマーダイマー形成だけに原因を押し付けるのではなく、私の何かがおかしいのだなと思えました。ありがとうございます。 今日早速ラボに着いたらもう一度挑戦してみます。 泳動も今回は確認せず、Dpn1処理してプレートしてみます。 それに、変異体を特異的にピックアップするようのコロニーPCRプライマーもあるので、そうですね、まず出たコロニーを全てPCRするくらい力技を行なっています。 それでもうまくいかなければ、教授にお願いして新しい酵素を試させてもらいます。 はい、プライマーは完全にオーバーラップしてデザインするものを用いています。 すみません、アニール温度の50度に関してですが、増幅が見られないので、どんどん低くしていった結果が50度です。プライマーのTmは66度です。 みなさん、私の言葉足らず、理解力不足のため混乱を招いてしまい申し訳ありませんでした。 まずは多くの方からコメントいただいたように、増幅されていないように見えてもまずは形質転換してみるということ。それから新しい別の酵素（PrimeSTARやKOD -Plus- Neo)を試してみようと思います。 みなさま、本当にたくさんのコメントをいただきありがとうございました。 また結果を追ってお知らせさせてください。

(無題) 削除/引用 No.8879-16 - 2020/06/01 (月) 22:24:58 - AP Inverse PCRは言わずもがなPCRですがquick change はPCRではないですから。 でも、そうですね。質問者さんのいうとおりにstrand displacementしないPfuを使っているならそもそもPCにはならない、quick pcrのデザインになりますね。

(無題) 削除/引用 No.8879-15 - 2020/06/01 (月) 21:45:49 - ちき >[Re:12] APさんは書きました : > inverse PCRは初発の鋳型に対して背中合わせの(inverse)プライマーを使うってだけのことです。オーバーラップ云々は含意しない。 だとしたら、quickchangeでないことは文脈から明らか、というのは変ですね。inverse PCRとquickchangeは排反でないことになるので。

(無題) 削除/引用 No.8879-14 - 2020/06/01 (月) 21:29:53 - 774R Tm=50℃のプライマーが68℃や72℃で十分にアニールして問題なくPCR産物が得られると思ってるならなんでも72℃でやれば良いだけの話。

(無題) 削除/引用 No.8879-13 - 2020/06/01 (月) 21:17:50 - AP > 元々Tmが50℃のプライマーでやってもアニールせんよ？ 必ずしもそうは言えないんじゃないか？ そもそもTmというのは相補鎖の50%がアニールする温度であって、温度に対するアニールはゼロ百じゃないので。

(無題) 削除/引用 No.8879-12 - 2020/06/01 (月) 21:13:28 - AP > 1. 完全にオーバーラップしてデザインするもの。 2. 3'突出にデザインするもの。 3. オーバーラップしないようにデザインするもの。 の3通りあって、1をQuickChange、3をinverse PCRと呼んでいると理解しています。間違っていたら指摘してください。 inverse PCRは初発の鋳型に対して背中合わせの(inverse)プライマーを使うってだけのことです。オーバーラップ云々は含意しない。

(無題) 削除/引用 No.8879-11 - 2020/06/01 (月) 20:41:28 - 774R つか、質問者はどんなプライマーを使ったのかくらい書きましょうよ。 そもそも最初のPCR条件でアニール温度50℃なんかにしてるけど、そんなにTmの低いプライマーを作ったのかな？　オリゴDNAなんか安くなってるんだからそんなケチる意味ないですよね？ ということは50℃という設定は何も考えずにやったの？ それから72℃でツーステップでやってるみたいだけど、元々Tmが50℃のプライマーでやってもアニールせんよ？

(無題) 削除/引用 No.8879-10 - 2020/06/01 (月) 20:19:07 - ちき 何か用語が統一されてなくて混乱を招いている気がしますが、プライマーペアを 1. 完全にオーバーラップしてデザインするもの。 2. 3'突出にデザインするもの。 3. オーバーラップしないようにデザインするもの。 の3通りあって、1をQuickChange、3をinverse PCRと呼んでいると理解しています。間違っていたら指摘してください。1の場合はlinear amplificationにしかならないのはすでに指摘がある通りです。個人的には1と2しか経験がありませんが(mpさんの紹介してるtakaraのキットなど)、増幅効率を求めるなら当然exponentialな2のほうが高いです。DpnI消化も必要ありません。 ただ増幅と意図しないエラーはtrade-offなので、PCR産物が目視できなくてもtransformationしてみるというはひとつの考え方だと思います。

(無題) 削除/引用 No.8879-9 - 2020/06/01 (月) 19:43:52 - いやいや この時点ではどのシステムを使って変異を入れようとしてるかは確定しませんがなw

(無題) 削除/引用 No.8879-8 - 2020/06/01 (月) 18:23:53 - AP Agilentのプライマーデザインソフトウェアを使って変異プライマーを設計したとは書いてあるけれど、Agilent (Stratagene)の変異導入システム Quick Change を使ったとはひっと言もおっしゃっていません。文脈から言って inverse PCR 法なのは明らかですね。 inverse PCR法の実践では、必ずしも泳動でPCR産物が見えていなくてもいいんだけれど（取り込みエラーによる変異を防ぐため、サイクルを10回以下など少なく設定するので）、予備実験で普通にPCRかけたときに標的特異的産物の増幅が十分に増えているのが見えないといけない。 mutagenesisとかあんまり関係なくて、単純にPCRがかからないって問題に尽きると思います。鋳型が単離精製されたプラスミドで十分な量、入っているんだから、増えて当たり前みたいな実験でなのに増えないってのは、やっぱりおかしい。 酵素変えちゃうのが手っ取り早いと思うな。 Pfuシリーズは増幅に失敗することが多くてあんまり印象が良くない。 Pfuは校正活性のあるアーキア好熱性ポリメラーゼの走りで、発売当時は他に競合製品もなくて、期待を込めてよく使ったもんだけれど、残念なことが多くて。今は、製品も改良されて良くなっているのかもしれないけれど、他社競合製品にも優秀なのが増えてきたからね、Pfuには全然、執着がない。

常識かもしれませんが・・・ 削除/引用 No.8879-7 - 2020/06/01 (月) 15:25:44 - カートン箱 Inverse PCRからIn fusionで変異導入する場合も、Quickchangeで変異導入する場合も、PCR産物はDpnI処理しておくべきですね。 DpnIでテンプレートプラスミドを消化しておかないと、テンプレートプラスミドがバックグラウンドとして大半を占めてしまいます。 （なお、DNA methylase欠損株で増幅したプラスミドはDpnIで消化できません。そんな株を使うことはそうそうないと思いますが・・・）

(無題) 削除/引用 No.8879-6 - 2020/06/01 (月) 12:46:54 - mp これが一番簡単でしょうか。 ttp://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100005179 別にMAXを使う必要もないと思いますし。

(無題) 削除/引用 No.8879-5 - 2020/06/01 (月) 10:34:20 - 774R >site directed mutagenesis AgilentということはQuickChangeのシステムですかね？ あれは厳密にはPCRではありませんから明確なバンドが出なくても問題ないですよ？通常はバンドなど確認せずそのままトランスフォームです。 個人的にQuickChanngeは変異未導入のバックグラウンドが高い印象なので、インバースPCRの方が成功率高いですね。それとインバースPCRの時にオーバーラップする配列を付加してIn-Fusionでやるのリン酸化不要で楽ちんです。

(無題) 削除/引用 No.8879-4 - 2020/06/01 (月) 04:23:52 - 住野 おお先生、ありがとうございます。 PCR酵素が過去のトピックとしてLA Taqが紹介されていました。 それ以外にPhusionも古いですがあるので試してみます。 ベタインはおそらくラボにはないのでシークエンスコアを尋ねてもらってみます。 タッチダウンPCRは試したことがありませんので、まずは調べてみます。 この度は有益な情報をいただきありがとうございます。

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