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(無題) 削除/引用 No.8860-8 - 2020/05/22 (金) 13:18:41 - WInter-8 > ごめんなさい，本当に初歩的な質問で申し訳ないのですが，その，ヘリックスとか，βシートとかいう，二次構造が存在する領域と，ランダムコイル・フレキシブル領域という判断はどうすればいいのでしょうか． > 二次構造予測ですか？ 二次構造予測でも良いのですが、分子置換に使ったテンプレートと比較すればわかるのでは…。 テンプレートには、抜けている部分の構造はあるんですよね？ PyMol等でテンプレートの構造と現在精密化している構造を表示して比べてみたとき、抜けている部分はどういった構造ですか？ たとえば、ヘリックスやシートの途中であるとか、あるいは、分子表面につきだしたループ構造であるとか。 一般にαヘリックスは安定なので電子密度も明瞭に見えます。一方、分子表面では主鎖であってもフレキシブルで電子密度が観測できないこともあります。分子内部であっても、基質認識に関わる領域がフレキシブルなこともあります（そういう部分は基質結合にともなってinduced fitして見えたりもします）。 今回の質問にある“抜けている部分”がそのフレキシブルな領域であれば、よくあることです。 一方、“抜けている部分”がヘリックスの途中であれば、何か問題or特別な事情があると思います。 それと、最初に聞くべきだったのですが、 全アミノ酸数と“抜けている部分”のアミノ酸数はどれぐらいですか？

(無題) 削除/引用 No.8860-7 - 2020/05/21 (木) 22:52:53 - Plant WInter-8さん 早速答えていただき，ありがとうございます． ＞指導教官がccp4時代からの経験者？！　 だったら、指導教官に聞いた方が良いです。 それぞれの研究室で好みのプログラムがあるでしょうし、 ネットで聞いたから〜では気を悪くする先生方もおられます。 そうですよね･･･ 先生も，経験者ではありますが，一時期構造生物学から離れていた人なので，どうしようかな，うーんという感じだったので，現役でバンバンやっていらっしゃる方に聞いてみたくて． ＞”主鎖が抜けている”というのは、”主鎖の電子密度が一部見えていない”ということでしょうか？ 電子密度が見えていないのはαヘリックスですか？βシートですか？ どちらでもなくて、ランダムコイル やフレキシブル領域であれば、 flexibilityが高くて見えていないだけだと思います。 ごめんなさい，本当に初歩的な質問で申し訳ないのですが，その，ヘリックスとか，βシートとかいう，二次構造が存在する領域と，ランダムコイル・フレキシブル領域という判断はどうすればいいのでしょうか． 二次構造予測ですか？

(無題) 削除/引用 No.8860-6 - 2020/05/21 (木) 18:24:36 - WInter-8 > 現在，使っているのはCCP4iで間違いありません．指導教官がccp4→ccp4iと使ってきたらしく，最初にやり方を教えていただいたのがccp4iだったので，そのまま使っていました．i2の方がいいのですね，ちょっと使い方など探してみます． 指導教官がccp4時代からの経験者？！　 だったら、指導教官に聞いた方が良いです。 それぞれの研究室で好みのプログラムがあるでしょうし、 ネットで聞いたから〜では気を悪くする先生方もおられます。 と言いつつ、お答えします。 molrepのログを見る限り、問題ないと思います。 > Rfac/Rfreeは，順調に下がっていまして，現在0.24/0.27付近です． これだけ下がっていれば十分でしょう。 他のパラメーターに大きな問題がなければ、ほぼ正解だと思います。 > 問題の部分以外は，よくはまっているように思います． > 電子密度がないだけでしょうか・・・？ ”主鎖が抜けている”というのは、”主鎖の電子密度が一部見えていない”ということでしょうか？ 電子密度が見えていないのはαヘリックスですか？βシートですか？ どちらでもなくて、ランダムコイル やフレキシブル領域であれば、 flexibilityが高くて見えていないだけだと思います。 いかがでしょうか。

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.8860-5 - 2020/05/21 (木) 17:01:36 - Plant WInter-8さん コメントありがとうございます． 現在，使っているのはCCP4iで間違いありません．指導教官がccp4→ccp4iと使ってきたらしく，最初にやり方を教えていただいたのがccp4iだったので，そのまま使っていました．i2の方がいいのですね，ちょっと使い方など探してみます． 最適解のログは以下の感じです． | TF/sg wRfac Score | +----------------------------------- | 10.59 0.610 0.38209| | 3.23 0.631 0.32444| | 3.62 0.631 0.32408| 2.96 0.628 0.32404| Tf/sgが大きくなっていたので大丈夫だと判断していましたが，言われてみると，Rfacがそれほど変わらないのは気になりますね･･･． Rfac/Rfreeは，順調に下がっていまして，現在0.24/0.27付近です． 問題の部分以外は，よくはまっているように思います． 電子密度がないだけでしょうか・・・？

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.8860-4 - 2020/05/21 (木) 16:54:06 - Plant おおさん 以前もご助言いただきありがとうございます． そうですね，相同性のある結晶構造を元に位相を決めるソフトだと思っています(違っていたらすみません) 現在，問題となっている部分は，類似配列を持つタンパク質の構造がなく，モデリングが難しいという可能性はあるかと思いますが，普通，主鎖が抜けてしまうと言うのは聞いたことがないもので･･･．

(無題) 削除/引用 No.8860-3 - 2020/05/20 (水) 11:23:03 - WInter-8 結晶屋です。 > ccp4iのmolrepで， 最初に確認なんですが、ccp4iで合ってますか？ 構造解析を始めたばかりの方でしたら、ccp4i2をおすすめします。 > この場合，molrepによる分子置換が失敗したと判断するものなのでしょうか． molrepの古いバージョンでは、非対称単位中の分子が重なり合ったモデルが得られることもありましたが、途中の主鎖が抜けるという経験はないです。 最近のプログラムは無茶苦茶なモデルを出すことは少ないので、モデルだけを見て結果を判断することは不可能だと思います。 非常に基本的なことですが、以下の３つは必ず確認します。 　molrepのログを見て、最終解のR-factorが他の候補と比べて顕著に低いか？ 　精密化計算を流して（サイクルは少なくても良い。というかrigid body refinementだけでよい）、R, Rfreeが下がるか？ 　さらに、電子密度を俯瞰的に見て、モデルが2Fo-Fcマップと一致しているかも確認する。 一度試してみてください。

(無題) 削除/引用 No.8860-2 - 2020/05/19 (火) 23:55:49 - おお ちょっとそのソフトはよく知りませんが、なにか決められた結晶構造などをもとに類似蛋白の構造を当てはめるようなソフトでしょうか？ ならばオリジナルの構造で構造が決まっていない部分がそのまま反映されている可能性はないでしょうか。

分子置換失敗･･･？(結晶構造解析) 削除/引用 No.8860-1 - 2020/05/19 (火) 13:20:17 - Plant いつも大変お世話になっております． さて，現在，ある植物由来の酵素タンパク質について，構造解析を行っております． ccp4iのmolrepで，配列同一性30-40%のテンプレートを用いて，分子置換を行ったところ，途中の主鎖が10残基ほど抜けているモデルが構築されました．(他にもところどころ抜けている部分があります) タンパク質は全長のものを使用しており，配列も問題ないことを確認しております． この場合，molrepによる分子置換が失敗したと判断するものなのでしょうか． 初心者のため，このような場合，この先どのようなアプローチを踏めば良いか分からず困っています． ご助言をいただきたく，投稿させていただきました． よろしくお願いします．

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