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クローニングでオススメのPCRポリメラーゼ　2020年度版 トピック削除
No.8852-TOPIC - 2020/05/15 (金) 08:26:50 - PCR
定期的に興味が湧くことですが、cDNAから1-3kbほどの遺伝子をクローニングする際、私はいつもPfu Ultra IIを使っていますが、特にこれに拘る理由はありません。

ただ、中々クローニングがうまくいかないこともあることはあります。

みなさんのクローニングの際に用いるPCR酵素の第一選択とそれがうまくいかなかった時の第二選択をお聞かせくださいませんでしょうか？

よろしくお願いします。

私はPfu Ultra IIが第一選択です。
ラボの予算の関係で第二選択が持てません...
　
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No.8852-13 - 2020/05/19 (火) 20:14:33 - amp
ニッポンジーンのGo-to DNA Polymeraseを使ってますが、
安いけどちゃんと走りますよ。

(無題) 削除/引用
No.8852-12 - 2020/05/19 (火) 18:41:27 - 橘
私のおすすめはQ5ですが、KOD OneやPhusion、Platinum SuperFi IIも良いと思いますよ。
これらはバッファ組成の違いから、最適なアニーリング温度がTaqとは全く異なりますので注意が必要です。
Q5とPhusionはNEBの下記サイトを使ってアニーリング温度を決めます。
http://tmcalculator.neb.com/
Taqに比べてかなり高めの温度が推奨されます。
Taqと同じアニーリング温度だと、ノンスペが出やすいです。
Platinum SuperFi IIは普通のプライマーは全て60℃でいいとのことです(本当か？)。
KOD Oneは、東洋紡がTm計算用エクセルファイルを公開していますが、Taqと共通になっています。
サンプル品でやった限りではPhusionと同じくらいにした方が良いように感じました。

(無題) 削除/引用
No.8852-11 - 2020/05/18 (月) 13:48:59 - QT
お気に入りの酵素一つの他に、一つか二つ（ソースが）違う
酵素を用意しておくのがおすすめです。経験的に、PCRがう
まくいかなかったら、条件をあれこれいじるより（アニーリン
グ温度を２，３試すことはしますが）、酵素を変えるとあっ
さりうまくいくことが多いです。それでもだめならプライマー
を設計し直します。

(無題) 削除/引用
No.8852-10 - 2020/05/17 (日) 00:20:28 - PCR
みなさん、ありがとうございます！
たくさん聞いたこともない酵素を挙げていただいてびっくりしました。
安価で校正機能があれば素敵ですね！

実は週末にラボのストックを漁り、LA TaqとPhusion HF polymeraseを見つけました。
容量が少なかったのでたくさん条件検討できませんでしたが、LA Taqの法で非常に薄いですが、予想される場所にバンドがシングルででました。

サイクル数は33です。
LA TaqはTaqの誘導体ということですので、fidelityが気になります。
来週中にはアドジーンからその遺伝子が届くことは届くので、今やってるcDNAからのクローニングは必須ではありません。やはりやめといた方がいいですね。

Phusionの方でもバンドが出ましたが、そちらでは多くのバンドが出てしまいました。

(無題) 削除/引用
No.8852-9 - 2020/05/16 (土) 10:25:31 - 774
Tks Gflexをおすすめします。
PrimestarでPCRがかからなかったターゲットでも、今のところ問題なくかかってます。

(無題) 削除/引用
No.8852-7 - 2020/05/16 (土) 09:06:15 - おかねない
安いので

KAPA HiFi を使っています。

https://www.n-genetics.com/products/search/detail.html?product_id=4093

25サイクルほどで使っていますが、何も問題になったことがないです。

(無題) 削除/引用
No.8852-6 - 2020/05/16 (土) 06:22:43 - おお
伸長活性が強い（強そうな）もととして、
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
PrimeSTAR

何でもかかりそうな感触。感触だけであまり科学的ではないですけど。

(無題) 削除/引用
No.8852-5 - 2020/05/16 (土) 03:36:47 - PCR
みなさん、ありがとうございます。

フィデリティに関しては今のものでも問題はありませんが、私がよく遭遇するのは、PCRが全くかからない、です。500bp程度であればまず大丈夫ですが、たまに50％ほどのクローニングでPCRが全くかかりません。

KOD plus neoやKOD FX neoは評判いいみたいですね！
早速それで行ってみます♫ありがとうございます♫

(無題) 削除/引用
No.8852-4 - 2020/05/15 (金) 14:48:26 - toto
KOD plus neoでまずやってダメなときはKOD ONE, それでもダメで長い産物にはKOD FxNeo。これでダメなら、半分にしてPCRして出たらNEBuilderでつなぐ。

(無題) 削除/引用
No.8852-3 - 2020/05/15 (金) 14:16:09 - AP
>ただ、中々クローニングがうまくいかないこともあることはあります。

どこがどううまく行かないかが問題。

(無題) 削除/引用
No.8852-2 - 2020/05/15 (金) 14:13:03 - BOSS
正直メジャーなメーカーからハイフィデリティーの酵素買っておけばそんなPCRエラーに出会う機会そうそう無い印象。
東洋紡のKODとかNEBのQ5、どれも使ったけど大きな差があるように感じなかった。
もちろん超長いPCRかけるのであれば性能差は多少出てくるんだろうけど。

クローニングでオススメのPCRポリメラーゼ　2020年度版 削除/引用
No.8852-1 - 2020/05/15 (金) 08:26:50 - PCR
定期的に興味が湧くことですが、cDNAから1-3kbほどの遺伝子をクローニングする際、私はいつもPfu Ultra IIを使っていますが、特にこれに拘る理由はありません。

ただ、中々クローニングがうまくいかないこともあることはあります。

みなさんのクローニングの際に用いるPCR酵素の第一選択とそれがうまくいかなかった時の第二選択をお聞かせくださいませんでしょうか？

よろしくお願いします。

私はPfu Ultra IIが第一選択です。
ラボの予算の関係で第二選択が持てません...
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