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(無題) 削除/引用 No.8850-2 - 2020/05/15 (金) 01:42:18 - M 実際に二次抗体だけでウエスタンしてみて、IgH/Lのバンドが出たという事でしょうか？ 純化したB細胞でウエスタンやった事はないですが、B細胞が50%以上を占める脾臓のライセートでウエスタンした場合で、IgH/Lが問題になった経験がないです。脾臓のB細胞が発現するのはIgM/IgDですから、二次抗体のIgGへのspecificityが高ければ、少なくとも重鎖については問題なさそうな気もするのですが。 軽鎖については抗マウス２次抗体のウエスタンで出ても良い気がするのですが、個人的にはそのような経験がないですね。何でだろ？ IPの時はIgL出るから、IgLを検出できる二次抗体を使っているはずなんですが。 とりあえず非還元で流して、二次抗体だけでウエスタンすれば、何を見ているのか検討がつきそうですね。

マウスB細胞のウェスタンブロット 削除/引用 No.8850-1 - 2020/05/14 (木) 21:45:50 - tracker お世話になります。 マウスより単離した脾臓B細胞をサンプルとしてSDS-PAGE/WBを行い、検出用二次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体を用いると、当然ですがIgの重鎖/軽鎖がかなり強く検出されてしまいます。 そうすると20-50 kDaあたりのターゲットを検出する際にかなり邪魔になります。 マウスB細胞を扱っている方はこの問題をどのようにクリアされているのでしょうか？ 以下の3案が思い浮かびましたが、どれが効果的か試されたことがある方がいればご意見を伺いたく存じます。 1次抗体を変更するのはコスト的にも大変なので避けたいところですが、、。 1.1次抗体のホストをマウス→ラビット等へ変更 2.conformation-specificな2次抗体を使用する 3.非還元状態でSDS-PAGEを行う（B細胞由来のIgのバンドがかなり上の方にいってくれるはず）

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