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ちき様 削除/引用 No.8829-9 - 2020/05/08 (金) 13:58:19 - ウエスタン初心者 ご回答いただきありがとうございました。 同様の手法にて実験をおこなっておられるとのことで、大変心強いです。 是非ご教示いただいた方法にて評価を行ってみようかと思います。 今後ともどうぞよろしくお願いいたします。 ありがとうございました。

独り言様 削除/引用 No.8829-8 - 2020/05/08 (金) 13:57:16 - ウエスタン初心者 ご丁寧に回答いただきありがとうございました。 >>サンプルを一度泳動してゲルをCBB染色してから定量して、泳動し直してウエスタンですかね。 当初ご提示いただいた方法で行おうかと思っていたのですが、CBBの定量感度を勘案しますと各レーンごとのタンパク量を正確にあわせる(補正)ことがどこまで信頼性を持っておこなえるのか(正確なのだろうか)と思いまして、質問させていただきました。 確かにb-アクチン等のバンドの濃さで合わせて、ある程度等量のタンパク量サンプルをロードする方法が一般によく用いられているものと想像しておりますが、他の手法がもしあればなぁと思って質問させていただいた次第です。 ありがとうございました。

7744様 削除/引用 No.8829-7 - 2020/05/08 (金) 13:52:07 - ウエスタン初心者 >>シグナルは実際の細胞死より先に動くので、細胞はまだ死んでいないがシグナルが動いているというタイムポイントでサンプル作製するのがベター 親切にありがとうございます。 細胞増殖抑制活性評価のタイミングよりもずいぶん前のタイミングとなりますので、気をつけて行ってみようかと思います。 死に始めとなると確かにシグナルが走った後の表現系をみていることになりますものね。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8829-6 - 2020/05/08 (金) 10:58:54 - ちき >[Re:4] 7744さんは書きました : > シグナルは実際の細胞死より先に動くので、細胞はまだ死んでいないがシグナルが動いているというタイムポイントでサンプル作製するのがベターだと思います。 > どうしても死に始めてから見たいのであれば、接着細胞は通常通りlysisしつつ、浮遊細胞は別にチューブなりに回収して、遠心してからまとめるというので良いと思います。 これに同意します。私も細胞が浮きはじめた時点では、別に回収して合わせていました。細胞がかなり死んでいる時点やdoseにおけるサンプルで何を基準にするかは正解のない問題で、そのような点におけるデータは参考にしかならないと思います。

(無題) 削除/引用 No.8829-5 - 2020/05/08 (金) 10:44:56 - 独り言 ロード量そろえるスタンダードは何かと問われたら、タンパク質定量でしょう。というか自分でわかっていながら質問されているので、何を期待した質問なんだろう。 スタンダードではないけど、どうしてもタンパク質定量できないのであれば、サンプルを一度泳動してゲルをCBB染色してから定量して、泳動し直してウエスタンですかね。 ただブラッドフォードなどと比べて、CBBだと画像で定量することになるので、定量範囲はきつくなってしまうけど。2−3倍程度の違いならちゃんと補正できるかな。

(無題) 削除/引用 No.8829-4 - 2020/05/08 (金) 10:25:34 - 7744 p53等関連タンパクのWBやってました。 シグナルは実際の細胞死より先に動くので、細胞はまだ死んでいないがシグナルが動いているというタイムポイントでサンプル作製するのがベターだと思います。 どうしても死に始めてから見たいのであれば、接着細胞は通常通りlysisしつつ、浮遊細胞は別にチューブなりに回収して、遠心してからまとめるというので良いと思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.8829-3 - 2020/05/08 (金) 07:46:53 - ウエスタン初心者 おお様 早速のご返信ありがとうございます。 おっしゃる通り、タンパク質定量をしてから流す方が一般的ですよね。 まずはスタンダードなやり方でやってみます。 Hot lysis bufferの情報もありがとうございます。 是非検討してみます。 引き続き皆さま、経験談等お持ちでしたらどうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.8829-2 - 2020/05/08 (金) 07:18:49 - おお ９６穴なら蛋白定量するぐらいの量はなんとかなりそうですが。どうせ５０ulぐらいは使わないとうまく回収できないだろうし、そこから５ulぐらいあれば定量に回せるのだから。 Lysisはみたいターゲットによるだろうけどたいていバッファーが使用可能かと思いますし。 どうしてもサンプルバッファーのようになるべくすべて抽出してと思っているならHot Lysis bufferでもいいでしょう。１％SDS、でTRISでpH８か７強にしたものです。その他は人によって若干違います。 また、細胞が均一にまけているて結構細胞が少ないのなら、顕微鏡の写真撮ったフィールドに何個細胞があるのかでもやれるかもしれません。

細胞毒性のある化合物のウエスタンブロット 削除/引用 No.8829-1 - 2020/05/08 (金) 07:02:15 - ウエスタン初心者 いつも勉強させていただいております。 最近、あるメカニズムにてがん細胞の細胞増殖を濃度依存的に抑制する化合物を見出しました。 p53を含め複数のシグナル経路関連タンパク質をウエスタンブロットにて追いたいのですが、その際のサンプル調整はどのようにするべきなのでしょうか。 βアクチンやGAPDHのバンドが揃うタンパク濃度で流して検出すればいいのはわかるのですが、いかんせん化合物の処理で細胞数が減るので、どのようにロード量を揃えるべきなのか、そのスタンダードがわからずにいます。 タンパク濃度を測定してから流せばいいと言われれば何も言い返せないのですが、96ウェルプレートでサンプル調整をしたい兼ね合いもあり、ウェルにダイレクトにサンプルバッファーを添加する形を取りたいのですが… コツやテクニック等ありましたらご教示いただけますとありがたいです。 よろしくお願いします。

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