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(無題) 削除/引用 No.8828-11 - 2020/05/20 (水) 19:49:05 - あおい １様 おお様 ありがとうございます。 大変勉強になりました。 参考にして引き続き検討いたします。

(無題) 削除/引用 No.8828-10 - 2020/05/10 (日) 06:27:35 - おお >[Re:8] １さんは書きました : > 質問5回答 > やめたほうがいいです。やばいです。１回目の時の１次抗体とHRP-標識2次抗体が膜上にそのまま残っているわけですが、このHRPはまだ活性ありますので基質かければまた反応します。あればかなりタフな酵素ですので油断できません。 アザイド使えば不活性化できます。順番は基本弱いシグナルが出る方から検出して次に強い方を使えば最初の抗体からのシグナルが無視できるほど弱くなることが期待できることも多々あります。またその様になるように抗体の量とか工夫するか。

(無題) 削除/引用 No.8828-9 - 2020/05/10 (日) 00:15:16 - １ 訂正 5行目　誤）見ずに　　→ 正）　水に

(無題) 削除/引用 No.8828-8 - 2020/05/10 (日) 00:13:17 - １ 質問3回答 お使いのPVDF膜の添付書類にあると思います。WEBでPVDF, CBB, westernとかで検索すればたくさんできます。どの組成も大差ないと思います。大事なことは脱色しすぎないように、目で見ながら脱色して、いい感じより少し前くらい（バックはまだなんか青いけど、（量の多い蛋白質のバンドは見えてきたくらい）で見ずに変えることです。しすぎたら再度染色からやり直せばいいだけですが。 質問4回答 skim milk, BSAいずれも使ってますが、ストリッピング等特別なことは特にしなくても綺麗に染まり、乾燥後はバックも白いです。染色する前に膜を乾かしてしまったことがあり、そのときはバックが染まりまくって失敗したことあります。なのですぐに染色しないときは水につけて乾かないように保管してください。 もう一つはポアサイズが0.2μmのPVDFは通常使う0.4μmのやつよりもバックが高く脱色がイマイチの気がしてます。 質問5回答 やめたほうがいいです。やばいです。１回目の時の１次抗体とHRP-標識2次抗体が膜上にそのまま残っているわけですが、このHRPはまだ活性ありますので基質かければまた反応します。あればかなりタフな酵素ですので油断できません。かなり強い条件でストリッピングしてもまだ少し反応することあるし。なので２回目の抗体の検出の時に、１回目の抗体とそれのHRPもまた反応して２つが重なった感じ（下駄みたいな感じ）になるので、比較するものが5~10倍くらいの明瞭な差異があるなら大きな問題にならないかもしれないですが、2倍くらいとかだと誤った判断をしてしまう危険があります。ストリッピングもそれはそれで問題がなくはないですが、しないで起こる上のような問題と比べれば、まだずっと小さいです。

(無題) 削除/引用 No.8828-7 - 2020/05/09 (土) 12:55:31 - あおい 皆様 ありがとうございます。 質問２のwestern blotのバンドとCBB染色を縦並び表記については、同じ電気泳動の異なるゲルを使用、とのことで把握いたしました。 ゲルの曲がり具合まで同じものがしばしば散見されたので気にはなっていましたが、おお様のおっしゃるとおり、別の膜だからいけない、というわけではないことも理解できました。 アミドブラックはいままで検討したことがありませんでしたが、面白そうなので予算に余裕があれば購入検討して比較もしてみたいと思います。 皆様の意見を参考にして、 （余裕があれば）ゲル２枚を電気泳動し、うち１枚をCBB染色で撮影保存。 (毎回) transfer後のmembraneをポンソー染色で撮影保存し、ブロット反応へ。でまずは見てみたいと思います。 CBBはナカライのBullet CBB Stain One(Ready To Use)がゲル染色においては非常に簡便で使いやすいのですが、membraneでの検出は試したところいまいちな印象でした。脱色の過程が酢酸などではなく水という点がmembrane使用でないのかもしれません。 この機会なので追加で不明点なども列挙させていただきます。もしおわかりの方はいらっしゃれば皆様の研究室での一般的な方法など共有いただけましたら幸いです。 質問3 膜の染色にCBB染色液を使用されている方はどういったもの（組成）を使用されておりますか？No.8828-4の１様のお返事にありますが膜用というのがあるのでしょうか？ 質問4 ブロットが終わった後のPVDFのCBBあるいはアミドブラック染色はストリッピング後のmembraneを使用しておりますでしょうか。特にスキムミルクなど使用したあとのmembraneは真っ青になっており（当然？）、タンパクがほとんど見えない経験があります。脱色処理によってバックが消えてくるのでしょうか？（前述のとおり、私が使用しているBullet CBB Stain Oneでは脱色処理がないのでうまくいかないだけなのかもしれませんが） 質問5 これはCBBと関係ありませんが、ずっと気になっていたのでもしよろしければ。 リン酸化⇒totalで検出する際、通常はリン酸化タンパク⇒ストリッピング⇒totalタンパクでブロットするかと思います。 ストリッピングをせずにそのまま１次抗体以降の処理をすることはいかがでしょうか？（特に１次抗体の動物種が異なる場合は分子量が同じですし、そのまま上にtotalタンパク抗体を上からかぶせてしまうことができる気もするのですが）

(無題) 削除/引用 No.8828-6 - 2020/05/09 (土) 08:57:16 - GLUT4 ブロットが終わった後のPVDFをCBBで染めて論文に載せています。 ポンソーと比べてやはりCBBの方が感度は良いです。 まだ使っていませんが、「ラピッドCBB脱染色キット」を使えば、CBB染色後のメンブレンを脱色してウエスタンブロットに使用できるようです。

(無題) 削除/引用 No.8828-5 - 2020/05/08 (金) 22:35:12 - AP >しかしながら、発表されている論文によってはwestern blotでのバンドとともにCBB染色の結果を下に並べているものも見受けられます それは同じ条件で泳動をdulicateして、一方をCBB染色して、他方をブロットに供しているんちゃうか？　CBB染色したゲルをブロットに供するなんてアホなことする人おらんと思うで。

(無題) 削除/引用 No.8828-4 - 2020/05/08 (金) 22:18:53 - １ westernして検出も全て終わった後に膜をCBB染色し、脱色します。脱色はしすぎないことがコツで、バックがまだ青いうちに脱色をやめて水に移し軽く洗ってから自然乾燥させます。乾くと、残っていたバックの青色が抜けて白くなりマイナーなバンドが鮮明に見えるようになります。乾かしてラップに包んでノートに貼ってます。膜の染色に使うCBB染色液と脱色液はゲルの染色用とは組成が少し違いますが、ゲル用の組成でもでもできることはできます。感度的にはポンソーやamido黒よりも確実に上です。欠点は染色・脱色の後に抗体反応ができない（ていうかバック上がりまくって真っ黒になって汚ないデータになります）ことです。 ポンソーSは染色、脱色してから抗体反応も可能です。抗体反応前に転写の確認をするにはいいですが、CBBと比べると感度がかなり落ちます。染色時には見えているバンドも脱色すると見え無くなったりとかもします。amido黒はCBBとポンソーの中間くらいです。ニトロセルロース膜を使うときはこれを使います。染色後に抗体反応は勧めません。

(無題) 削除/引用 No.8828-3 - 2020/05/08 (金) 12:04:44 - M ２番目の質問ですが、PVDFでウエスタンを全部（リブロットも含め）やってから、そのPVDF膜をアミドブラックで染めてます。論文にも何回か載せたことがありますが、査読で文句を言われたことはないです。CBBはゲルにしか使ってませんが、膜でも使えるだろうと思います。 １番目の質問（ウエスタン前に膜を染める）の場合は、ポンソーでやってます。この段階でCBBやアミドブラックを膜の染色に使うと、その後のプロセスに影響すると習いましたが、本当に影響するか自分で試したことはありません。CBBを使う必要性があるかと言われると、私の答えは「ない」になりますが、CBBが本当にウエスタンに影響するか試した方がいらしたら、どんな感じか聞いてみたい気もします。

(無題) 削除/引用 No.8828-2 - 2020/05/08 (金) 03:00:15 - おお ポンソーの染色はやるようにしています。局所的な泳動やTransferの乱れなど確認できますから。蛍光が見れるWBの撮影などの装置であれば赤が強く検出されるフィルターを入れる見やすい図が取れる事がまあまああります。 CBBはニトロセルロースには強く吸着してとりにくいようなので染めるには抵抗がありますが、染めれるというキットなどもありますので工夫しだいかとおもいます。PVDFのほうはまだ使いやすいようですが、個人的にはあまり経験がありません。CBB染色はWBの検出に影響が出やすいという記述がどこかにあった様な気がします（ミリポアの膜染色の解説だったかな）。 使った事はないけどアミドブラックも膜染色に使われているようです。アミドブラックをつかう溶液の組成によってはサポートされているニトロセルロース膜のサポート素材に影響があるという話を聞いたことがありますが、詳しくは知りません。酸が強すぎるのかな、、、 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/protein-blotting-handbook.pdf こちらを見るとCBBとアミドブラックは脱染色がしにくくって後に影響しやすいと書いてますね。CBBはBNPAGEをするとPVDF一面が真っ青になってしまいますがメタノールで洗い落とせばそこそこ取れてしまいますが。 ここまでで触れなかったのですが上記のURLに書いているように、PVDFではTransillumination も可能です。いちどやって見たんだけどそれほど綺麗じゃなかったんだよな。一部乾いちゃったからかな、、、 その他蛍光など使ったり色々商品は出ているようなので検索などもしてみるといいです。 ゲルを２枚用意して同じ容量をながしDuplicateにしておいて片方のゲルをCBB染色、もう一方をWBというのもありだと思います。いずれにしろTotalの蛋白の量を示したほうがべたーでそれをInternal controlの代わりに使う事もあります。Total蛋白のデーターは、たとえばInternal control用にWBしたタンパクが変動しているとかそういう話になるとTotal蛋白のほうが信用性がありますし。 片方をゲル、片方を膜では膜のほうがロードした蛋白量を正確に表すわけだからゲルの染色はどうかとか、Internal　Controlと示したいWBのタンパクがDuplicateしたちがう膜で検出するのはどうかという意見もあります。これに対して個人的な反論を書いておくとするならば（もちろん絶対的にこちらが正しいという事ではありません）、たとえば２つのちがう酵素反応など何等かの活性などを見るとき、違う反応系は違うチューブでは見れませんから、その２種類の活性の結果が比較できないかというとそういうわけではないでしょう。PCRもInternal ControlとTestするサンプルは違うチューブです（ひとつのチューブで出来る系も開発されているでしょうけど、必ずそうでないといけない話ではないでしょう）。反応（検出）系が違うなら同量をとって別々にアッセイして比較してもよいだろうと思っています。

western blottingにおけるCBB染色 削除/引用 No.8828-1 - 2020/05/07 (木) 21:17:13 - あおい タイトルの通り、western blottingにおけるCBB染色の意義について質問させていただきたいと思います。 各レーンに等量のタンパク質をアプライできているかの確認としてCBB染色を行うかと思いますが、一般的にはゲルの染色に用いられるかと思います。 ただ、みなさま経験あるかと思いますがCBB染色後のゲルのtransferはうまくいかないことが多く、あくまでCBBの目的は、電気泳動の確認（だけ）や、タンパク濃度が測定できないサンプルでの濃度比較などに用いられてるという印象でした。 しかしながら、発表されている論文によってはwestern blotでのバンドとともにCBB染色の結果を下に並べているものも見受けられます。 そこで下記質問おわかりの方は教えて下さい。 �@ western blot(抗体反応までの過程において)membraneを染められるポンソーS溶液ではなくあえてCBBを使う必要性はありますか？ ポンソーよりもCBBのほうが濃くしっかりと見えるような印象ですので私は個人的にはCBBがすきだったりしますが。。 �A CBB染色結果とwestern blotting結果を縦に並べているものはどのように染色をしているのでしょうか？？(membraneをCBBで染めてから脱色している？) わかりにくい質問かもしれませんがよろしくお願いします。

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