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(無題) 削除/引用 No.880-6 - 2012/08/31 (金) 19:17:16 - こまり みなさん、ありがとうございます。 >[Re:5] さくさんは書きました : > 液体培地でプラスミドを落としやすいやつは、プレートに密集する感じに生えるように播種して、、、 それは、ありかもしれませんね。 >[Re:4] ~さんは書きました : > そのくらいまでの量であれば、いい条件を探すよりも力技で進めたほうが早くできるかもしれません。 そうですね。 >[Re:2] おおさんは書きました : > あとはローコピーNoで増やしておいて回収の直前にハイコピーNoになる様にコンディションをかえるとか。 > ローコピーNoは低温や低いこうせい物質濃度でコントロールできます。 ハイテクですね。 今回は、１００-200 ug/ml で高めのアンピシリンを使っています。 長時間培養のほうが、私は収量が一般に高いのですが、今回は見直さないといけないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.880-5 - 2012/08/31 (金) 11:08:51 - さく 液体培地でプラスミドを落としやすいやつは、プレートに密集する感じに生えるように播種して、生えた大腸菌をプレートからこそげ取って、それで菌体が足りないときは液体培養を2〜3時間ぐらい培養すると、取れることがあります。 やるときはサテライトがヤなので、プレートには気休めでアンピシリンの代わりにカルベニシリンを使っています。

(無題) 削除/引用 No.880-4 - 2012/08/31 (金) 07:47:10 - ~ 目的は収量を得ることですよね。 種培養を用意しながら、朝と夕方に数Lずつ回収・培養を繰り返す。 回収した菌はアルカリSDS法→イソプロ沈までのストックとしておく。 必要量が集まったら、まとめて超遠心精製。 たとえば3L分を振ることができれば、平日一週間だけで、30L分の菌体が得られます。 そのくらいまでの量であれば、いい条件を探すよりも力技で進めたほうが早くできるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.880-3 - 2012/08/31 (金) 04:31:12 - おお クロラムフェニコールはpBR由来のoriでつかわれますがpCDNA3はpUCのoriだったと思いますのでそれほど有効でないかもしれません。ただそれでも使う人がいるかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.880-2 - 2012/08/31 (金) 02:08:51 - おお 結局プラスミドの配列依存的なもののようですね。大腸菌を複数おもちならいっせいに使えるもの全部にトランスフォーメーションして良さげなものがないか探ってみるのもてかもしれません。 あとはローコピーNoで増やしておいて回収の直前にハイコピーNoになる様にコンディションをかえるとか。 ローコピーNoは低温や低いこうせい物質濃度でコントロールできます。わたしは大腸菌が増えてきたら遠心して新しいバイチに更新して1ー3時間培養しています。通常のやり方より可也修了がいいようなきがしてます。特にアンプは培養中にどんどん分解されますから、回収時にはコピーNoが下がっている事はあり得ると思ってます。

プラスミドの収量　何かコツ 削除/引用 No.880-1 - 2012/08/30 (木) 21:44:17 - こまり 現在のpcDNA3をベースとする、10ｋｂのインサートをもつプラスミドの収量が低くて困っています。 よくあるテクの、アンピシリン+クロラムフェニコールはとくに明らかな改善なしでした。 何かコツがありましたら、お願いします。 （ちなみに、巨大な〜1２ｋｂのインサートをもつべつのヤツはよく取れます。） （ちなみに、pcDNA3ベースで5ｋｂインサートをもつのもよく取れます。）

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