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(無題) 削除/引用 No.8785-10 - 2020/04/20 (月) 21:49:52 - ｆ 精巣の一部の細胞は自家蛍光ありますよ。

(無題) 削除/引用 No.8785-9 - 2020/04/20 (月) 17:56:07 - AP 余談ですが、 ピクリン酸は構造に亀の甲をもつので高い自家蛍光を引き起こすので、ブアン固定は蛍光免疫染色に向かないと言う人もいます。 DABではworkしていたので問題ないと思いますが、ブアンは固定がきつすぎて著しく抗原性を損なうので免疫染色には向かないという人もいます。

(無題) 削除/引用 No.8785-8 - 2020/04/20 (月) 17:35:01 - ゴン太 状況的には、私もAPさんのご指摘のようにまずは「2nd抗体の有無」で、同等の蛍光が複数のチャンネルで再現するかを実験する方が良さそうに思います。

(無題) 削除/引用 No.8785-7 - 2020/04/20 (月) 17:19:50 - AP フィルターセットを変えてもみんな光って見えるってときは、 自家蛍光の場合もあるけれど、散乱の可能性も高い。 なにか光を散乱させるような構造やゴミがあったりしたとき。

(無題) 削除/引用 No.8785-6 - 2020/04/20 (月) 16:48:02 - TM AP様 ありがとうございます。 試薬の見積もりをうかがうところでした。 まず、免疫蛍光染色の手順を省いて行ってみます。 そのうえで、試薬検討してみます。 重ねてになりますが、本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8785-5 - 2020/04/20 (月) 16:44:58 - TM ゴン太様 早速のお返事本当にありがとうございます。 免疫蛍光染色自体が不慣れなもので自家発光について勉強していきます。 試薬についても検討させていただきます。 無理だとあきらめておりましたが、光が差しました。 S/N比についてですが、詳細な検討はできておりませんが、 DAB時　 一部の細胞質のみ 蛍光時　上記細胞以外の一部の細胞の核（DABで陰性）で強い反応 DAPIの蛍光channelでも蛍光が観察されるため、自家発光の可能性が高いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8785-4 - 2020/04/20 (月) 16:34:48 - AP すでに指摘がありますが、自家蛍光の可能性があります。 一次抗体スキップだけじゃなく、二次抗体もスキップして（というより免疫染色の過程を全て省いた切片をマウンドして）検鏡してみてください。

(無題) 削除/引用 No.8785-3 - 2020/04/20 (月) 15:24:48 - ゴン太 二次交代→二次抗体です。すみません。

(無題) 削除/引用 No.8785-2 - 2020/04/20 (月) 15:23:43 - ゴン太 なんとも言えませんが、TMさんが出している情報から類推するに、 可能性１）二次交代Fc部と核の何らかの構造の非特異的結合 可能性2）自家蛍光 この辺りをまず怪しむでしょうかね、、、。しかし可能性1だとするとDABでも二次交代を使用しているでしょうからその可能性は低いかもですね。もちろん感度の問題でという可能性はありますが。自家蛍光は結構broadな波長で観測されるものも多く、 ttps://www.cosmobio.co.jp/product/detail/bti-20140616-1.asp?entry_id=12798 ttps://www.funakoshi.co.jp/contents/67661 原因によってはこれらの試薬が奏功する場合もあります。私はTrueviewの方で改善しました。 何れにせよS/N比の情報が欲しいところです。 例）DAB時　　細胞質のみ 　　蛍光時　　細胞質>核 のような、、、。

2次抗体の非特異的反応なのか教えてください。 削除/引用 No.8785-1 - 2020/04/20 (月) 14:58:06 - TM お世話になります。 初めてご質問させていただきます。 現在、マウス精巣（ブアン液固定）のパラフィン切片5μmを使用し、免疫蛍光染色をしております。事前に施行していたDABを用いた免疫染色では、核が染色されなかったのですが、間接免疫蛍光染色をすると一部の核で蛍光が観察されたため、1次抗体を除いた陰性コントロールを用い、2次抗体のみで免疫蛍光染色を行いました。 使用した二次抗体は、 �T、Alexa488（Goat anti-rabbit igG H&L）, �U、Alexa568（Goat anti-mouse igG H&L）, �V、FITC（Goat anti-rabbit igG whole molecule）　　です。 3種類の抗体を別々で使用したにも関わらず、同じ精細管Stageで同様の一部の核（核膜ではなく、濃縮した染色体）で蛍光が観察されます。 ＊ブロッキングは、常温30分、60分でそれぞれ行っております。 ＊抗体の希釈濃度は、データシート通りに行っております。 このような経過です。 この蛍光は、非特異的反応と考えているのですが、免疫蛍光染色に詳しい者がおらず、本当にそうなのかと判断に苦慮しております。 直接法では費用面で対応が難しく、どのように対処すれば改善が得られるのかと、路頭に迷っております。 大変申し訳ありませんが、 �@非特異的反応と判断してよいのかどうか �A非特異的反応の場合、なんらかの対処で改善可能なものなのか。 について、お手すきのの際に、ご教授いただけますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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