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(無題) 削除/引用 No.8769-19 - 2020/04/15 (水) 11:18:07 - 流しの研究者 >[Re:18] ウイルス扱い初心者さんは書きました : > ＞流しの研究者様 > ありがとうございます。 > ウイルスはCOVID-19ではありません。 > > 今までの過去の論文から、全長のcDNA(ORFを含む)でなければ発現しないようです。 発現というのが気になるのですが、大腸菌で蛋白質を発現したいということでよろしいですね。ウイルスゲノム上にORFが１つということはありえないのですが、最も5'寄りのORFだけ発現ということでしょうか？ ウイルス扱い初心者さんは、蛋白質発現初心者でもあるのでしょうか？ 「全長のcDNA(ORFを含む)でなければ発現しないようです。」というのは、自分で確認できないのですか？いずれにせよ、何かがおかしいです。

(無題) 削除/引用 No.8769-18 - 2020/04/15 (水) 11:03:48 - ウイルス扱い初心者 ＞流しの研究者様 ありがとうございます。 ウイルスはCOVID-19ではありません。 今までの過去の論文から、全長のcDNA(ORFを含む)でなければ発現しないようです。

(無題) 削除/引用 No.8769-17 - 2020/04/15 (水) 09:53:28 - テレワーク もともとの質問に曖昧なところがあるせいで、皆さんそれぞれの解釈で回答されているようですね。 7kbのRNAウイルスの全長cDNAを、最終的には発現プラスミドにクローニングしたい。7kbのPCR産物を直接発現プラスミドにクローニングすればよいように思うのだが、指導教員はまず汎用的なクローニングベクターにサブクローニングして、その後に発現プラスミドにクローニングし直せと言う。なぜそのような迂遠な方法を取らなければいけないのか教えて欲しい。 お聞きになりたいのは、これで間違いないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8769-16 - 2020/04/15 (水) 09:19:34 - ちき メチレーションがdam methylationの意味なら、すでに回答があるように外来性のDNAであってもすぐにメチル化されるので問題ないはず(dam+の株の場合)。dam methylationされていないstrandを標的にするendonucleaseはmutH(uvrD)だと思いますが、普通使う大腸菌はこれを欠損していないです。

(無題) 削除/引用 No.8769-15 - 2020/04/14 (火) 22:52:19 - 流しの研究者 >[Re:13] ウイルス扱い初心者さんは書きました : > ＞AP様 > > ご指摘ありがとうございます。 > これからもご教授いただけますと幸いです。 > > クローニングする用のベクターと、遺伝子発現用のベクターは異なるのもを用いるのが一般的なのでしょうか。 > クローニング効率が非常に悪いのでなるべく1度のクローニングで済ませたいです。 ssRNA virusだから、cDNAをクローニングしたいと書いたのを軽く読み流していましたが、ここに来て発現という話が出てきました。つまるところ、virus genomeの遺伝子を発現させたいということですね。 virusは、COVID-19でよろしいですか？私も専門ではありませんので、全てを答えられませんが、少なくとも以下のことは考えてから、苦労ニングした方が良いと思います。 １）発現用にクローニングするのであれば、ゲノムcDNAではなくORFを発現ベクターにクローニングするべき、 ２）切断などのプロセッシングを受ける蛋白質であれば、プロセッシング酵素がそもそも存在しないと目的蛋白質ができない（前駆体でも良いのでしょうけど）、 ３）ORFがタンデムに並んでいるので、そもそも全長をクローニングしても全ては発現しないと思われる（安全面では何も心配しなくて良いですね）、 ４）そもそも大腸菌で発現できるのか（ホストが違うので蛋白質の産生が難しい場合がある）、 COVID-19は、こちらを解読してから、作業されることをおすすめします。 ttps://www.nature.com/articles/s41579-018-0118-9

(無題) 削除/引用 No.8769-14 - 2020/04/14 (火) 21:54:14 - おお >[Re:10] ウイルス扱い初心者さんは書きました : > 一般的なコンピテントセルは、メチレーションのないDNAを分解する機能を欠損していますよね。 Most E. coli hosts contain both DNA adenine methylation (dam) and DNA cytosine methylation (dcm) genes. These genes code for proteins that methylate specific sequences when DNA is propagated, making subsequent digestion with methylation-sensitive restriction enzymes impossible. https://www.agilent.com/en/product/mutagenesis-cloning/competent-cells-competent-cell-supplies/competent-cells-for-routine-cloning/jm110-competent-cells-233093 > > ＞単に全長DNAを持っていてもウイルスの生活環に入れない可能性はないですか？ > 私の勉強不足のため、この部分の内容が理解できません。 あなたのウイルスの名前と生活環でぐぐって見てください。

(無題) 削除/引用 No.8769-13 - 2020/04/14 (火) 21:20:58 - ウイルス扱い初心者 ＞AP様 ご指摘ありがとうございます。 これからもご教授いただけますと幸いです。 クローニングする用のベクターと、遺伝子発現用のベクターは異なるのもを用いるのが一般的なのでしょうか。 クローニング効率が非常に悪いのでなるべく1度のクローニングで済ませたいです。

(無題) 削除/引用 No.8769-12 - 2020/04/14 (火) 21:13:50 - ウイルス扱い初心者 ＞一学徒様 そうですよね。ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8769-11 - 2020/04/14 (火) 21:12:34 - ウイルス扱い初心者 ＞うい様 ＞PCRプロダクトをそのまま用いると攻撃されやすいみたいな話は 大腸菌内で大腸菌特有のメチレーションがないDNAは外敵として、分解されやすいという内容でご理解お願いします。 ウイルスはssRNAです。

(無題) 削除/引用 No.8769-10 - 2020/04/14 (火) 21:05:38 - ウイルス扱い初心者 初めてこの掲示板を利用するため不慣れなところもあると思いますが、お許しください。 ＞おお様 質問がわかりにくくて申し訳ございません。 大腸菌内で大腸菌特有のメチレーションがないDNAは外敵として、分解されやすいという話についてお聞きしたいことがあります。 一般的なコンピテントセルは、メチレーションのないDNAを分解する機能を欠損していますよね。 しかし私が7kbのインサートををクローニングしたところ、ほとんどが空、まれに3kb程度のインサートがあるという結果になりました。 これはインサートが大腸菌に分解されたということなのでしょうか。 インサートは目的サイズである7kbの部分をゲルから切り出し精製したものを用いました。 ＞単に全長DNAを持っていてもウイルスの生活環に入れない可能性はないですか？ 私の勉強不足のため、この部分の内容が理解できません。

(無題) 削除/引用 No.8769-9 - 2020/04/14 (火) 19:59:01 - おお ん、まえの質問とかから考えるにシーケンスしたいのかな、、、 ３０ｋｂｐだっけ、、よく使われるクローニングベクターではかなりきついな、、、 憶測だから、違うかもしれないが。

(無題) 削除/引用 No.8769-8 - 2020/04/14 (火) 19:55:47 - おお >[Re:6] APさんは書きました : > >それは指導教員に尋ねるべき質問です。 > > そりゃごもっとも >[Re:4] 一学徒さんは書きました : > それは指導教員に尋ねるべき質問です。 一つ心配なのは指導教員の答えがちゃんと理解できるだろうか（分からなかったからここで質問しているのかも）。質問の仕方とかからRNAウイルスはみんな同じように増殖するとか思ってはないだろうか。どういう立場で実験しているのか分からないけど、もし興味を持って自身のテーマの一部として実験しているのなら、勉強もしてほしいと思います。研究助手ぐらいの立場なら言われるとおりでもいいのかもしれませんが、それでも勉強して知識を吸収するなら将来的に差をつけれますし。

(無題) 削除/引用 No.8769-7 - 2020/04/14 (火) 17:45:53 - AP >クローニングして単一の配列をもったDNA分子を鋳型からスタートしたほうが、結果の評価や再現性などの上で優れている面はあるだろう。 例えば、ウイルスの変異率・変異速度や変異のスペクトラムを調べるというようなことをするとき、スタートの配列が一義的な方が格段にいいだろう。

(無題) 削除/引用 No.8769-6 - 2020/04/14 (火) 10:40:56 - AP >それは指導教員に尋ねるべき質問です。 そりゃごもっとも

(無題) 削除/引用 No.8769-5 - 2020/04/14 (火) 10:40:14 - AP PCRプロダクトはランダムに変異の入ったheterogenousな分子集団だから、 クローニングして単一の配列をもったDNA分子を鋳型からスタートしたほうが、結果の評価や再現性などの上で優れている面はあるだろう。

(無題) 削除/引用 No.8769-4 - 2020/04/14 (火) 10:05:13 - 一学徒 それは指導教員に尋ねるべき質問です。

(無題) 削除/引用 No.8769-3 - 2020/04/14 (火) 09:33:26 - うい 私もこの質問の意図が良く分からないのですが、特に ＞PCRプロダクトをそのまま用いると攻撃されやすいみたいな話 の部分が。 具体的にウイルスのfamilyくらいは言っても良いのではないでしょうか？そのほうが具体的な話ができる気がします。それが無理ならpositive or negative or dsでもいいので。

(無題) 削除/引用 No.8769-2 - 2020/04/14 (火) 07:49:08 - おお >[Re:1] ウイルス扱い初心者さんは書きました : なんだか質問が分かりにくいのだが、、、 ＞PCRプロダクトをそのまま用いると攻撃されやすいみたいな話 それは大腸菌内で大腸菌特有のメチレーションがないDNAは外敵として、分解されやすいという話の事を言っているのかな？ > 指導教員より、一度サブクローニングしてほしいと言われたのですが、サブクローニングするメリットはあるのでしょうか。 目的しだいで上記の理由で決めるわけではないと思います。PCRは比較的変異が入りやすいのでプラスミドDNAにしたほうが安心ではあります。ただそれも目的しだいです。 またそのウイルスはRNAウイルスなので、単に全長DNAを持っていてもウイルスの生活環に入れない可能性はないですか？プラスミドからRNAを発現させる必要があるかどうか考えてみてください。

感染性全長cDNAクローン作成 削除/引用 No.8769-1 - 2020/04/14 (火) 07:23:30 - ウイルス扱い初心者 現在RNAウイルスの感染性全長cDNAクローンの作出を行なっています。 指導教員より、一度サブクローニングしてほしいと言われたのですが、サブクローニングするメリットはあるのでしょうか。PCRプロダクトをそのまま用いると攻撃されやすいみたいな話を掲示板で見たことはありますが、その根拠となるような報告がありましたら教えていただきたいです。 よろしくお願いします。

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