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(無題) 削除/引用 No.8769-42 - 2020/04/15 (水) 20:07:55 - 流しの研究者 >[Re:41] ういさんは書きました : > > 全然関係ないのですが、一応。 > > ＞流しの研究者 > ウイルスゲノム上にORFが１つということはありえないのですが、最も5'寄りのORFだけ発現ということでしょうか？ ウイルス扱い初心者さんは、蛋白質発現初心者でもあるのでしょうか？ > > flavivirusはゲノム上にORFが一つですね。 > > 揚げ足取りみたいになったらすいません。 ありがとうございます。polyproteinの切断で複数の蛋白質が作れるので、ORFは１つでも大丈夫ですね！

(無題) 削除/引用 No.8769-41 - 2020/04/15 (水) 19:50:52 - うい 全然関係ないのですが、一応。 ＞流しの研究者 ウイルスゲノム上にORFが１つということはありえないのですが、最も5'寄りのORFだけ発現ということでしょうか？ ウイルス扱い初心者さんは、蛋白質発現初心者でもあるのでしょうか？ flavivirusはゲノム上にORFが一つですね。 揚げ足取りみたいになったらすいません。

(無題) 削除/引用 No.8769-40 - 2020/04/15 (水) 16:31:22 - AP 現に今、どんな宿主・ベクターにクローニングしようとしているのか（宿主はJM109というのがようやく漏れ出てきたが）、最終ベクターは何で、どういう使い方をしようとしているのか、 有り体に名前を出して、ストレートに質問したほうがいい。 質問者の考察とか聞きかじりの知識とか当てずっぽうとか思いつき（攻撃を受けやすい云々、pUCはどうなのとか、etc)を元に質問をするから、質問の本質がわからず混乱する。 事実と見解は明確に分けろ、一緒くたに語ってはいけない、なにより最初に、事実をありのままに記述しろ、自分の考えを述べるのはその次の段階、というのは論文指導でうるさく叩き込まれるところ。 pUCがいいか悪いかも、あなたのやろうとしていること次第で、 あなたのやろうとしていること、現にやっていことがさっぱりわからないんじゃ、一般論で答えても虚しいよね。

(無題) 削除/引用 No.8769-37 - 2020/04/15 (水) 16:20:21 - AP 私も最初は、in vitro transcriptionの鋳型にするだけなら（プロモータ配列付加の）PCR産物でいいはずなのに、一旦クローニングしろと指示されたのが納得いかない、って質問だと思ったんで、最初の返信では、その場合のクローニングすることの意義について書きました。 しかし、どうやら、PCR産物は転写ベクターに入れて転写させる計画らしい。だが、その前に一旦別の汎用ベクターにクローニングしろと指示されたのが納得いかない、ってことだった。しかも、その不満は、汎用ベクターへのクローニングがうまくいっていないから、こんなに苦労するんだったら、最初から発現ベクターに入れればいいじゃん、て八つ当たり。 いやいや、クローニングが容易な汎用ベクターでうまくいっていないのに、癖のある発現ベクターのようなもの（最終ベクターはなんだかはわからないけれど）ではいきなりクローニングなんてできませんよ、 ってところまできたのかな。 >論文を読んでいるとpUC18,pUC19を用いていることが多いように感じますが、これらのベクターはクローニングに適したベクターなのでしょうか。 pUC18/19はDNA断片のクローニングを目的とする近代的なベクターとしてはもっとも基本で、そのごのpBlueScriptとかpGEMとかのプロトタイプともなっているものです。薬剤選択のほか、blue/white selectionが使えるのが強みですね。 先の返信で書き忘れましたが、発現ベクターはblue/white selectionが使えないものが普通ですから、no insertでも区別がつかない。そういう点でも、歩留まりの低い一次クローニングには採用しにくい

(無題) 削除/引用 No.8769-35 - 2020/04/15 (水) 15:34:16 - 流しの研究者 >[Re:33] ウイルス扱い初心者さんは書きました : > 流しの研究者様 > ゲルに泳動して精製した程度では、長いDNAに短いDNAが入ってしまうのですね。 > 電圧やゲルの濃度を変えることで防ぐことはできないのでしょうか。 できません。 先に書きましたけど、短いDNAの量は少ないので、7kbのクローニング効率を上げる方に、考えを持っていくべきでしょう。 > ベクターよりインサートが大きい場合とベクターよりインサートが小さい場合ですと前者のほうがよいのでしょうか。 短いインサートの方が入りやすいですが、ベクターとの長さの比率は、そこまで影響しないです。 他の方への回答で理解しましたが、PCR productからin vitro転写することも可能ですが、鋳型をたくさん用意するのが大変だからクローニングするということですね。しかし、ただのクローニングの質問だったとは。。。

(無題) 削除/引用 No.8769-34 - 2020/04/15 (水) 15:23:36 - 流しの研究者 >[Re:31] 774さんは書きました : > 横からですがついでに。 > COVID−19は疾患名、SARS−CoV−2がウイルス名です。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8769-33 - 2020/04/15 (水) 14:32:16 - ウイルス扱い初心者 流しの研究者様 ゲルに泳動して精製した程度では、長いDNAに短いDNAが入ってしまうのですね。 電圧やゲルの濃度を変えることで防ぐことはできないのでしょうか。 ベクターよりインサートが大きい場合とベクターよりインサートが小さい場合ですと前者のほうがよいのでしょうか。 また室温での培養も試しましたがインサートは確認されませんでした。

(無題) 削除/引用 No.8769-32 - 2020/04/15 (水) 14:23:44 - ウイルス扱い初心者 AP様 その通りです。 インビトロ転写をして宿主に導入することを考えています。 論文を読んでいるとpUC18,pUC19を用いていることが多いように感じますが、これらのベクターはクローニングに適したベクターなのでしょうか。 また他にもクローニングに適したベクター、発現に適したベクターを教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.8769-31 - 2020/04/15 (水) 14:22:41 - 774 横からですがついでに。 COVID−19は疾患名、SARS−CoV−2がウイルス名です。

(無題) 削除/引用 No.8769-30 - 2020/04/15 (水) 14:19:07 - ウイルス扱い初心者 ちき様 ありがとうございます。 とても参考になります。

(無題) 削除/引用 No.8769-29 - 2020/04/15 (水) 14:18:00 - ウイルス扱い初心者 サブクローニングの話 私もとてもきになっていました。 教科書を調べても私の解釈と異なるものばかりだったので。 やはりただのクローニングと表記するのが正しいみたいですね。

(無題) 削除/引用 No.8769-28 - 2020/04/15 (水) 14:06:37 - 流しの研究者 >[Re:27] APさんは書きました : > 脇道ですが、 > > 指導者も質問者も使っている「サブクローニング」という言葉、 > 私には違和感があります。それはただの「クローニング」あるいは「一次クローニング」ではないか？ > 時代とともに言葉の概念は変遷し転化するものだから、現在では問題ないのかもしれないですが。 脇道に反応するのはあまり良くないと思いますが。 私も違和感がありました。 「クローニング」ですね。 もはや、「サブクローニング」＝「クローニング」、になっているのかもしれません。 > 私の理解では、 > subcloningとは一旦、別のベクターにクローニングされていたDNA断片を、切り出して、同じあるいは別の種類のベクターにクローニングすることで、特に元のクローン化断片から、その一部（sub-fragment)を別にクローニングことでした（単に同じ断片を別のベクターの載せ替えるだけならrecloningと言って区別した）。 > ゲノムライブラリーなど大きな断片のクローンから、そのsub-fragmentを解析のためにさらにクローニングするということがルーチンだったころ、この工程をsubcloningと言いました。 ですね。私もその世代ですね。 > 皆さんは違和感ないですか？

(無題) 削除/引用 No.8769-27 - 2020/04/15 (水) 13:54:07 - AP 脇道ですが、 指導者も質問者も使っている「サブクローニング」という言葉、 私には違和感があります。それはただの「クローニング」あるいは「一次クローニング」ではないか？ 時代とともに言葉の概念は変遷し転化するものだから、現在では問題ないのかもしれないですが。 私の理解では、 subcloningとは一旦、別のベクターにクローニングされていたDNA断片を、切り出して、同じあるいは別の種類のベクターにクローニングすることで、特に元のクローン化断片から、その一部（sub-fragment)を別にクローニングことでした（単に同じ断片を別のベクターの載せ替えるだけならrecloningと言って区別した）。 ゲノムライブラリーなど大きな断片のクローンから、そのsub-fragmentを解析のためにさらにクローニングするということがルーチンだったころ、この工程をsubcloningと言いました。 皆さんは違和感ないですか？

(無題) 削除/引用 No.8769-26 - 2020/04/15 (水) 13:51:11 - 流しの研究者 >[Re:10] ウイルス扱い初心者さんは書きました : > 初めてこの掲示板を利用するため不慣れなところもあると思いますが、お許しください。 > > ＞おお様 > 質問がわかりにくくて申し訳ございません。 > > 大腸菌内で大腸菌特有のメチレーションがないDNAは外敵として、分解されやすいという話についてお聞きしたいことがあります。 メチル化が生体防御機構のように働くことはありますが、ウイルス扱い初心者さんのDNAが短い理由ではないです。 > 一般的なコンピテントセルは、メチレーションのないDNAを分解する機能を欠損していますよね。 > しかし私が7kbのインサートををクローニングしたところ、ほとんどが空、まれに3kb程度のインサートがあるという結果になりました。 > これはインサートが大腸菌に分解されたということなのでしょうか。 なりません。 > インサートは目的サイズである7kbの部分をゲルから切り出し精製したものを用いました。 ゲルに泳動して精製した程度では、長いDNAに短いDNAが入っています。 例えば、RIで標識すれば、はっきり見えます。 短いDNAへの長いDNAのコンタミは、高次構造や荷電などの理由で、長いDNAの泳動速度が早くなるような特殊な条件を除けば、通常起きません。 ですので、3 kbのインサートが出るのは不思議ではありません。また、短い方がligationの効率が良いので、少なくても取れてきていしまいます。そもそも、7kbがcloningに困難な配列を持っていたり、vectorが大きくて、7kbのcloningが3kbに比べて圧倒的に不利な可能性があります。現在与えられた情報では判断できません。 なお稀にですが、繰り返し配列などを持っている特殊なDNAを含むプラスミドは、高温で増殖が早い条件にすると、大腸菌が苦しくなって、勝手に編集して短くすることがあります。overgrowthがひどいと、同様なことが起きると言われています。この場合は、低温(室温くらい）で培養すると改善することがあります。また、ホストも、不安定な配列用のものがありますので、試してみても良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8769-25 - 2020/04/15 (水) 13:32:31 - AP 感染可能はRNAウイルスゲノムのcDNAを取得し、それをin vitro転写、あるいはin vivo転写して、宿主細胞に導入してウイルスとして機能させる（virionを生じさせせる）、というような実験を想起しましたが、違いますか？ まあ、実験の詳細はどうでもいいですが、そう言う実験でなくても、 PCR産物を一旦別のベクターにクローニングしてから、最終ベクターにリクローニングする、ということは実際行いますし、意味があります。 最終ベクターが発現ベクターのようなばあい、一般的に発現ベクターはプライマリークローニングには向きません。 ・PCR産物など未クローニングの断片をベクターに入れるのは効率が良くない（末端構造の問題などで）ので、高効率の宿主ベクター系を選んだほうがいい。 ・発発現させるための仕掛け（プロモーター、推奨宿主など）がクローニングを妨げることがあるので効率の低下や目的クローンが取得できないという事態になりやすい（leaky expressionによる毒性、宿主ベクター系によって形質効率転換が低い、などによる）。PCR産物のように変異が散発しているようなものをクローニングする場合、多数のクローンを調べて配列が正しいものを選ばなければならい。そのためには、楽に多数のクローンが取れる宿主ベクター系にしたほうがいい。 ・一般的に低コピーのレプリコンであるのでプラスミド収量が低く、取得したクローンの検証（シークエンス）などに不利。 まあ、まだまだ、いろいろあると思いますが、一旦クローニングに適したベクターでクローニングしてシークエンスを確認してから、最終ベクターにリクローニングする、というのはある意味王道。

(無題) 削除/引用 No.8769-24 - 2020/04/15 (水) 12:19:20 - ちき すみません、dam/mutHは外来性のDNA排除にはあまり関係ないので忘れてください。余計なことを書きました。 お聞きになりたいのは通常の制限修飾のほうだと思います。これについてはJM109は制限(-)修飾(+)なので、修飾(dam methylaseとは違う配列のメチル化)を受けていないDNAを切断(制限)することはできません。JM109の遺伝子型のhsdR17(rK- mK+)がそれを表しています。したがってクローニングできないのは別の理由と思われます。

(無題) 削除/引用 No.8769-23 - 2020/04/15 (水) 12:02:34 - 流しの研究者 >[Re:21] ウイルス扱い初心者さんは書きました : > ＞流しの研究者様 > 私が発現用のベクターについて理解不足でした。 > 発現用ベクターというのは大腸菌で発現させるベクターというこのなのですね。 > 私は本来の宿主でウイルス遺伝子を発現させることが目的です。 > 大腸菌は本来の宿主ではありません。 質問は、以下でよろしいですか？ ウイルスゲノムcDNAの全長PCR産物を宿主細胞に導入して実験を行わないで、宿主発現ベクターにウイルスcDNAを組み込んでから、細胞に導入して実験を行う理由はなぜか？ 前者ができないのは、ウイルスが産生されて実験者が攻撃されるからなのか？ ウイルスの生活環がわからないと正確に回答できないですが、ヒトに感染性のウイルスだと、どちらも危険だと思います。むしろ、全長RNAが産生される後者がより危険な気がします。ヒト感染性である場合、ウイルス扱い初心者さんが、現在の状態で研究を行うことに、非常に大きな不安を感じます。ヒト感染性でなくても、不安はありますが。。。

(無題) 削除/引用 No.8769-22 - 2020/04/15 (水) 11:31:06 - ウイルス扱い初心者 ＞テレワーク様 その通りです。 私の文章のあいまいさと勉強不足のせいでいろんな方向に脱線していますが。

(無題) 削除/引用 No.8769-21 - 2020/04/15 (水) 11:29:20 - ウイルス扱い初心者 ＞流しの研究者様 私が発現用のベクターについて理解不足でした。 発現用ベクターというのは大腸菌で発現させるベクターというこのなのですね。 私は本来の宿主でウイルス遺伝子を発現させることが目的です。 大腸菌は本来の宿主ではありません。

(無題) 削除/引用 No.8769-20 - 2020/04/15 (水) 11:23:28 - ウイルス扱い初心者 ＞ちき様 すみません。聞きなれない単語ばかりでわからなくなってきました。 普段使っているコンピテントセルはJM109です。

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