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(無題) 削除/引用 No.8763-11 - 2020/04/14 (火) 13:22:51 - nonon 初心者ということなので、念のため。 HRP標識なのに、違う検出系を使ってしまっているとかは大丈夫ですか。

(無題) 削除/引用 No.8763-10 - 2020/04/14 (火) 10:43:19 - tts 前述の他の先生方の指摘に加え、いくつか気になった箇所があります。 ・泳動、トランスファーの両バッファーの使用期限は大丈夫か？ ・ラボで最適化した結果ならそれで良いのですが、トランスファーバッファーの調整がマニュファクチャープロトコールと違う。 　（マニュファクチャープロトコールではトランスファー 50mL+メタノール 100mL+Dw 850mL) ・抗体の使い回しはあるのか？ 最初にRIPAバッファーがおかしい可能性を挙げていましたが、考慮するにしても優先度は低いでしょう。 (極論ですが) やろうと思えばPBSでもタンパクは回収出来ます。加えて、実際にタンパク定量で十分なタンパク量を回収できている様なのでサンプル調整のステップは問題無い様に思います。 後は他の方も指摘された様に、CBB、ポンソーで泳動後のゲル、トランスファー後のメンブレンをチェックすれば概ね問題も解決できるのでは？と思います。

(無題) 削除/引用 No.8763-9 - 2020/04/13 (月) 16:37:08 - asan こればっかりはよくわからないので、きになる場所を全部変えて見るしかない。 マーカーが転写されてるなら、泳動転写までは概ねうまく言ってるとみなせるかと思います（CBBでメンブレンを染めてもいいが） 一番よくありがちなのは、1次2次抗体Washのバッファを間違えて作成した場合。SDS濃度とか界面活性剤の濃度をも違えたり10Xを作り置きして希釈してる場合は間違えてRunning bufferとかを使ってしまった場合などはSDS濃度が高すぎるので何も出てこなくなりますよ。 考えてもきりがないので、とりあえず抗体液以降のバッファーを全部作り直して見るしかないだろうね。作り直したら、検出しやすいloading controlで確認して見るのがいいです。

(無題) 削除/引用 No.8763-8 - 2020/04/13 (月) 14:29:03 - GG 4-12%ゲルで300kDaは分離可能だが、泳動上は予想よりも高分子側にでてるかもしれない。 以前、高分子の目的バンドが見れないと騒いでいたヒトがいたが、泳動後のゲルの上端のウエル部分と一緒に分離ゲルも数ミリ切り落としてしまっていたのが原因でした。 あと、引用文は素のままコピペで、自分の文章に>>をつけていますが非常に読みづらいです。

(無題) 削除/引用 No.8763-7 - 2020/04/12 (日) 00:58:37 - 流しの研究者 >[Re:4] かぶとさんは書きました : > 2.この抗体のウェスタンに関しては一度もうまくいっていない。 > ＞＞これに関しては2です。 かぶとさんが検出しようとしている蛋白質の動物種と、抗体が認識できる動物種は合致していますか？ ケミルミ発色後に取得した画像データについてですが、長時間露光でマーカーの部分に、ケミルミのシグナルはありますか？あれば、発色試薬と２次抗体のHRPは、大丈夫である可能性が高いです。逆に、まったく真っ白であれば、それらを疑った方が良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8763-6 - 2020/04/11 (土) 08:20:10 - おお >[Re:5] かぶとさんは書きました : > > まあそれでもGAPDHはかなり強く出る事が大抵（抗体や方法論にもよるけど）なのでまったくシグナルが出ないというのは不思議です。 > ＞＞いつもGAPDHは強くですぎるぐらいなのに、今回はまったく出ていないため、何がおかしかったんだろうと思っています。 > > > 2次抗体がだめになっている可能性（４度で長期間保存に向いてない）かケミルミ試薬がだめになっているか（商品にもよるが、２ヶ月ぐらいで使用期限が切れるものがおおい）。 > ＞＞いずれも購入したばかりです。 ケミルミ試薬や二次抗体は念の為ロットを確認してメーカーに問い合わせてみてください、大昔ですが代理店がアマシャムかファルマシアの在庫のむっちゃ古いものを持ってきて使ったけど全然反応せず、会社に問い合わせたら期限切れのロットだったことが判明したことがある。 ま、２次抗体とケミルミきっとを混ぜて発光を検出できるので、至適濃度が割り出せるならそれで反応系がワークしているかは大まかにわかるでしょう。一度調べてやってみると今後のトラブルシューティングのとき応用できますし。 > ーそれぞれの電流、電圧を確認しいつもと同じような値か（定電圧なら電流、定電流なら電圧をチェック）。もちろん泳動でゲルを二枚使うと同じ電圧で一枚のときより二倍の電流が流れるし、ゲルの厚さが変わると電流もちがうのでそういうのを考慮したうえで。 > ＞＞1枚でも2枚のゲルでも毎回定電流350mA, 90分のtransferです。 なんか会話が成り立ってませんが、、、

(無題) 削除/引用 No.8763-5 - 2020/04/11 (土) 06:58:03 - かぶと 転写に泳動用バッファーを使っているのですか？SDSが入っているため膜にうまく蛋白が吸着されていないのでは？ 普段は泳動用にTransfer Bufferを使っているのですか？なぜそんな複雑な事をしているのですか？Transfer BufferにSDSはたぶん入ってないだろうから（入ってたとしても非常に低濃度）、泳動がうまく行くほうが不思議。 ＞＞失礼しました。正しくは 普段使っていて今回切らしていたrunning buffer: NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) 50mL + DW 950mL 今回使ったrunning buffer: 20X Bolt MOPS SDS Running Buffer 50mL + DW 950mL 今回も含め毎回使っているtransfer buffer: NuPAGE Transfer Buffer (20X) 50mL + DW 950mL + メタノール 200mL です。 まあそれでもGAPDHはかなり強く出る事が大抵（抗体や方法論にもよるけど）なのでまったくシグナルが出ないというのは不思議です。 ＞＞いつもGAPDHは強くですぎるぐらいなのに、今回はまったく出ていないため、何がおかしかったんだろうと思っています。 2次抗体がだめになっている可能性（４度で長期間保存に向いてない）かケミルミ試薬がだめになっているか（商品にもよるが、２ヶ月ぐらいで使用期限が切れるものがおおい）。 ＞＞いずれも購入したばかりです。 泳動がちゃんと流れているか。 ーマーカーがちゃんと流れているか ートランスファー後の膜の染色 ＞＞マーカーは流れています。ポンソーはさぼってしまっていました。やってみます。 泳動、トランスファーが正常か？ ーそれぞれの電流、電圧を確認しいつもと同じような値か（定電圧なら電流、定電流なら電圧をチェック）。もちろん泳動でゲルを二枚使うと同じ電圧で一枚のときより二倍の電流が流れるし、ゲルの厚さが変わると電流もちがうのでそういうのを考慮したうえで。 ＞＞1枚でも2枚のゲルでも毎回定電流350mA, 90分のtransferです。

(無題) 削除/引用 No.8763-4 - 2020/04/11 (土) 06:46:14 - かぶと ご丁寧にありがとうございます。 1.この抗体のウェスタンに関して今までうまくいっていたのが急におかしくなった。 2.この抗体のウェスタンに関しては一度もうまくいっていない。 どれですか？ ＞＞これに関しては2です。 泳動〜転写の工程は大丈夫みたいですし、異なる１次抗体が２つとも同時にダメという不運も確率的にはあまり多くないと思うので、サンプルのアプライか、2次抗体反応からECL等による検出のあたりに原因があるような気がします。周囲に同じような実験してる人いたら、一度工程を確認してもらうか見せてもらうと意外とすぐ解決すること多いです。 ＞＞たしかに異なる1次抗体が2つ同時にだめになるのはないですね。。 ミニゲルならば40マイクログラム/laneはかなり多いと思うのですが（うちらは通常数マイクロg~10マイクロg/laneの範囲です。）、多すぎてシグナル強度が飽和してしまうようだとシグナルが何も見えなくなります。同様に多すぎると当該タンパク質が膜への結合容量を超えてしまいタンパク質の上にタンパク質が積み重なるような感じになってしまうことがあります。抗体は膜上で山積みされた最外部のタンパク質すなわち膜に直接結合していないまま乗っかってるだけのタンパク質に結合するため、洗浄中にこれらのタンパク質が外れると抗体も一緒に取れてしまいます。結果として膜に抗体は残りませんのでシグナルが出ません。なのでアプライ量を段階的に変えてみることも検討ください。 ＞＞なるほどです。そういうことがあるんですね。それはまったく知りませんでした。量を調整してやってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8763-3 - 2020/04/11 (土) 05:08:21 - おお >[Re:1] かぶとさんは書きました : > ・泳動：20X Bolt MOPS SDS Running Buffer 50mL + DW 950mL > ・転写：NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) 50mL + DW 950mL + メタノール 200mL > ・普段は泳動のバッファーとして、NuPAGE Transfer Buffer (20X) 50mL + DW 950mLを使っているのに、ストックがなくなっていたために上記のBoltに変えたため 転写に泳動用バッファーを使っているのですか？SDSが入っているため膜にうまく蛋白が吸着されていないのでは？ 普段は泳動用にTransfer Bufferを使っているのですか？なぜそんな複雑な事をしているのですか？Transfer BufferにSDSはたぶん入ってないだろうから（入ってたとしても非常に低濃度）、泳動がうまく行くほうが不思議。 まあそれでもGAPDHはかなり強く出る事が大抵（抗体や方法論にもよるけど）なのでまったくシグナルが出ないというのは不思議です。 ＞300kDaのたんぱくをみるのにNuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gelsでも大丈夫でしょうか？ 4%からのGradientなので３００ｋDaは一般論として検出できるでしょう。 2次抗体がだめになっている可能性（４度で長期間保存に向いてない）かケミルミ試薬がだめになっているか（商品にもよるが、２ヶ月ぐらいで使用期限が切れるものがおおい）。 バッファーについてはちゃんとした知識（組成が分かっている事も含め）がない限り、代わりに使うとかいうのはやめたほうがいいのではないかと。 ウエスタンで普段からいかの事は確認しながらやってください（特に初心者は）。 泳動がちゃんと流れているか。 ーマーカーがちゃんと流れているか ートランスファー後の膜の染色 泳動、トランスファーが正常か？ ーそれぞれの電流、電圧を確認しいつもと同じような値か（定電圧なら電流、定電流なら電圧をチェック）。もちろん泳動でゲルを二枚使うと同じ電圧で一枚のときより二倍の電流が流れるし、ゲルの厚さが変わると電流もちがうのでそういうのを考慮したうえで。 トランスファーがちゃんとされているか。 ーマーカーがちゃんと膜に転写されているか ートランスファー後の膜の染色に異常がないか。 ートランスファー後のゲルに蛋白が検出されるか（これは絶対とまで言いませんが、感覚がつくまでは確認をしておくほうがいいと思います）

(無題) 削除/引用 No.8763-2 - 2020/04/11 (土) 03:49:23 - d+fgvbhjuik 1.この抗体のウェスタンに関して今までうまくいっていたのが急におかしくなった。 2.この抗体のウェスタンに関しては一度もうまくいっていない。 どれですか？ 泳動〜転写の工程は大丈夫みたいですし、異なる１次抗体が２つとも同時にダメという不運も確率的にはあまり多くないと思うので、サンプルのアプライか、2次抗体反応からECL等による検出のあたりに原因があるような気がします。周囲に同じような実験してる人いたら、一度工程を確認してもらうか見せてもらうと意外とすぐ解決すること多いです。 ミニゲルならば40マイクログラム/laneはかなり多いと思うのですが（うちらは通常数マイクロg~10マイクロg/laneの範囲です。）、多すぎてシグナル強度が飽和してしまうようだとシグナルが何も見えなくなります。同様に多すぎると当該タンパク質が膜への結合容量を超えてしまいタンパク質の上にタンパク質が積み重なるような感じになってしまうことがあります。抗体は膜上で山積みされた最外部のタンパク質すなわち膜に直接結合していないまま乗っかってるだけのタンパク質に結合するため、洗浄中にこれらのタンパク質が外れると抗体も一緒に取れてしまいます。結果として膜に抗体は残りませんのでシグナルが出ません。なのでアプライ量を段階的に変えてみることも検討ください。またタンパク質濃度の定量とかアプライ量の計算間違えて（単位とか）、実際にはわずかしかタンパク質をアプライできてないとかも初心者の方のミスには割とよくあります。

ウエスタンのバンドがでない 削除/引用 No.8763-1 - 2020/04/11 (土) 03:07:07 - かぶと 基本的な事ですが、教えて下さい。 ウエスタン初心者ですがバンドがでない（目的たんぱく300kDa、コントロールのGAPDHいずれも）ということが2回続いて困っています。今までこのようなことは経験したことがありません。ちなみにマーカーはメンブレンにしっかりと転写されています。 また、実験の条件は以下のような感じです。 ・ゲル：Invitrogen #8482;　NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-wellに40ug相当のたんぱくをアプライ ・泳動：20X Bolt MOPS SDS Running Buffer 50mL + DW 950mL ・転写：NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) 50mL + DW 950mL + メタノール 200mL ・1次抗体：いずれの抗体もrabbit抗体、1:1000, 4C overnight ・2次抗体：Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 1:2000 RT 1hr １．初心者なのでわからないのですが、考え得る要因として以下のものを考えました。 ・RIPA bufferがおかしい？ ・普段は泳動のバッファーとして、NuPAGE Transfer Buffer (20X) 50mL + DW 950mLを使っているのに、ストックがなくなっていたために上記のBoltに変えたため ・抗体の問題？（ただ、抗体は購入したばかりです） ２．ついでにもう一つ質問ですが、300kDaのたんぱくをみるのにNuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gelsでも大丈夫でしょうか？

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