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(無題) 削除/引用 No.8751-12 - 2020/04/23 (木) 13:09:31 - AP >分配の際の確率的なゆらぎから必然的に起こるもので、 だからこそ、複数種のコンストクトを導入できたとして、細胞ごとにそれぞれのコピー数が違い、したがって産物の比率も違うものが混在した系になると思うのだけれど、そういうことは問題にならない？

(無題) 削除/引用 No.8751-11 - 2020/04/23 (木) 10:14:24 - ちき >[Re:10] 和合の湯さんは書きました : > plasmid incompatibilityは分配の際の確率的なゆらぎから必然的に起こるもので、積極的な排除メカニズムがある訳ではないという話が過去に紹介されていました。 紹介どうもありがとうございます。非常に興味深かったです。 この数学セミナー増刊号の記事、大昔に読んだ気がする...。

(無題) 削除/引用 No.8751-10 - 2020/04/23 (木) 09:31:24 - 和合の湯 plasmid incompatibilityは分配の際の確率的なゆらぎから必然的に起こるもので、積極的な排除メカニズムがある訳ではないという話が過去に紹介されていました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=4;Code=3040

(無題) 削除/引用 No.8751-9 - 2020/04/23 (木) 09:12:16 - ちき こんなのありました。 https://academic.oup.com/peds/article/20/7/309/1546372 昔から言われている"plasmid incompatibility"も、ちょっとドグマ化していたのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8751-8 - 2020/04/23 (木) 06:06:41 - タンパク初心者 複数のプラスミドを使用する方法は、英語のサイトで見つけました。 相当数まで使えるようです。 昔、大腸菌のtwo-hybridをやった経験もあります。２つのplasmidを用います。 （遺伝子作成がpBluescriptなどと比べ、なかなか困難でした。理由は不明です。コピー数が低いのが、一つの問題でした。）今回も、サイズが大きくなるにつれ、mini-prepでのDNA収量が下がり、制限酵素での解析（短いフラグメント）が困難です。 一応、低レベル、かつ不安定ではありますが、複数プロモーターでの誘導も可能でした。 発現量の問題もあるので、複数発現は最初のスクリーニング（２タンパク間の反応、結合など）にとどめ、アタリのクローンをシングル発現の系でさらに確認する方向です。

(無題) 削除/引用 No.8751-7 - 2020/04/12 (日) 11:02:40 - 流しの研究者 >[Re:1] タンパク初心者さんは書きました : > 大腸菌で複数遺伝子発現を目指しております。できればアラビノースやIPTGで発現調節したいです。 > plasmidで遺伝子を二つ繋げるだけで、うまくいく事もあるようです。 > やってみましたが、発現量は相当低いです。一応、最低限の発現はあるようです。 > 何か良い方法はあるでしょうか？ > pET duetは入手方法が見つからなかったのと、発現調節をここの遺伝子でできないこと、普通の大腸菌(XL-1)ではタンパク発現がうまくいかないとのことです。 > > 一方、複数のplasmidを入れて、複数遺伝子発現するのは、oriが同じだとうまくいかないことが多いとのこと。 > 出来るだけ一つのplasmidでやりたいのですが、良いお知恵を、お願いします。 異なるなる薬剤耐性を有する２つの発現ベクターに、それぞれ異なる遺伝子のcDNAを入れ、２つの薬剤を含む培地で培養し、例えばIPTG（２つのベクターともにT7である必要はありますが）で誘導できます。私が自力で思いついて実行した方法ですが、おそらく他にも同じことを考えた人もいるはずです（不勉強で申し訳ありません）。論文としても出ています。３つ以上でやったことはありませんが、理屈上はできるはずです。

(無題) 削除/引用 No.8751-6 - 2020/04/12 (日) 09:53:51 - タンパク初心者 みなさま、貴重なご意見、ありがとうございます。 2Aの話は、知りませんでした。興味深く拝読しました。文献も、（困難でしたが）拝読。大腸菌では難しいようです。 （やってみる価値はあると思いますが、すでに１年以上、時間を無駄にしております。ここは安全策が良いと思います。） GFP-CHX (pK7WGF2) and CHX-GFP (pK7FWG2) Constructs、参考になります。ただ、サイズが１０kb以上。凡人が扱うサイズではないように思います。 プロモーターを一つでやるというアイデア、哺乳類遺伝子ばかり扱ってきたので、新鮮です。 ・・・思うに、PCR2.1など、ペニシリン耐性、カナマイシン耐性です。マップを見て、勝手に「２つの耐性遺伝子を発現している」と、考えていました。（だから、シングルプラスミドで、複数の遺伝子発現は可能なはずと、思いました。） 遺伝子発現の程度を調べるため、出来るだけ簡単で、感度の高い発現系（GFPは高くない）が必要なように考えます。

(無題) 削除/引用 No.8751-5 - 2020/04/07 (火) 08:32:35 - おお >No.8751-1 - 2020/04/06 (月) 07:12:01 - タンパク初心者 >plasmidで遺伝子を二つ繋げるだけで、うまくいく事もあるようです。 >発現調節をここの遺伝子でできない plasmidで遺伝子を二つ繋げるだけといいますが、それならポリシストロニックと思えます。そうすると、発現調節をここの遺伝子するのはつなげるだけの単純なものではできないです。 プラスミドのプロモーターによっても選ぶ大腸菌種が違うわけだし。もう少しどんなコンストラクトでどのように発現したいのか書いてもらったほうが何かと意見が付きやすいかと思います。 大腸菌のポリシストロニックで遺伝子の間にコンディショナルターミネーターがついているものもあるかと思いますので、自身で勉強して望んでいるものに近いコンストラクトを作るのも手かもしれません。 単純なポリシストロニックベクターであれば https://www.addgene.org/29775/ RBSの位置に注意しながら遺伝子を挿入するといいでしょう(もしかしたら自分で入れないといけないのかもしれませんが詳細を見てないので確認してください)。pETベースなので通常のクローニング用の大腸菌株では発現しませんので注意してください。 もしかしたらRBS自分で入れないといけないのかもしれませんが詳細を見てないので確認してください あとは既存のベクターから切り貼りするか。 例えば（詳細は見ておらず見当違いかもしれませんので自身で確認ください） science.umd.edu/CBMG/faculty/sze/lab/CHX/RES/gfp/chx_gfp.html ccdBとCmRがポリシストリニックになっているように見える。 www.nature.com/articles/srep15081/figures/1 ccdBとAmpRがポリシストリニックになっているように見える。 これらはIPTG誘導性かかくにんしてませんが、IPTGでゆうどうするccdBもあったと思いますので使えるのがないか調べてみたらいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8751-4 - 2020/04/06 (月) 17:19:02 - AP どうでもともとバクテリアはポリシストロニックな遺伝子発現をするんだから、一個の誘導プロモータの下に二個の遺伝子をタンデムにして、それぞれの翻訳開始の前にRBS (Shine-Dalgarno (SD) 配列）つけとけばいいような気がする。 >普通の大腸菌(XL-1)ではタンパク発現がうまくいかないとのことです。 そもそもプロモータがT7だからうまく行かないどころじゃない。lac pro-T7 RNA polを乗せたlambda(DE3)プロファージをもった宿主でなければならない。

(無題) 削除/引用 No.8751-3 - 2020/04/06 (月) 16:23:31 - おお >[Re:2] えさんは書きました : > 2A self cleavable peptide The 2A system does not work in prokaryotic cells... https://www.intechopen.com/books/biotechnology/growing-uses-of-2a-in-plant-biotechnology どうでしょう

(無題) 削除/引用 No.8751-2 - 2020/04/06 (月) 08:07:23 - え 2A self cleavable peptide

大腸菌　複数遺伝子発現 削除/引用 No.8751-1 - 2020/04/06 (月) 07:12:01 - タンパク初心者 大腸菌で複数遺伝子発現を目指しております。できればアラビノースやIPTGで発現調節したいです。 plasmidで遺伝子を二つ繋げるだけで、うまくいく事もあるようです。 やってみましたが、発現量は相当低いです。一応、最低限の発現はあるようです。 何か良い方法はあるでしょうか？ pET duetは入手方法が見つからなかったのと、発現調節をここの遺伝子でできないこと、普通の大腸菌(XL-1)ではタンパク発現がうまくいかないとのことです。 一方、複数のplasmidを入れて、複数遺伝子発現するのは、oriが同じだとうまくいかないことが多いとのこと。 出来るだけ一つのplasmidでやりたいのですが、良いお知恵を、お願いします。

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