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(無題) 削除/引用 No.875-10 - 2012/08/28 (火) 09:06:50 - ~ >C末端側に活性中心があることが分っており、さらに分子量が10kDa位小さかったため これは、分子量マーカーから計算した分子量が、アミノ酸配列から計算される分子量よりも10kD小さかったという意味でしょうか？ 活性のあるendoのタンパク質と同時に流して、10kD分くらい下に出たという意味でしょうか？ 前者ならば、その方法では目的タンパク質の分子量の話はできないでしょう。 後者ならば、Hisタグの影響は無視できないでしょうけれども、何回か違うコンストラクトなども使っているくらい時間をかけているのであれば、 C末にもタグをつけて2回精製したフルレングスのコンストラクトも試してみてはいかがでしょうか。 C末側のタグのせいで活性がなくなるかもしれませんが、なくならなければより"いい精製"がされたタンパク質が得られるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.875-9 - 2012/08/28 (火) 08:57:20 - おお ミスフォールディング=封入体形成でしょうか? >>c末が削れて活性が消失する事が明らかになってますか? >C末端側に活性中心があることが分っており、さらに分子量が10kDa位小さかったため、C末端側の切断？と思った次第です。 いろいろなアイソフォームをためされているのなら、それらと比べても大きさ(SDSPAGEでの挙動)がおかしいと言えるなら、なにかベクターの遺伝子に起こっているというのはある程度現実味が出てきますが、、、

(無題) 削除/引用 No.875-8 - 2012/08/28 (火) 08:33:13 - azara ＞ おおさん >c末が削れて活性が消失する事が明らかになってますか? C末端側に活性中心があることが分っており、さらに分子量が10kDa位小さかったため、C末端側の切断？と思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.875-7 - 2012/08/28 (火) 08:29:49 - azara ＞おおさん > > 昆虫細胞であっても過剰発現によりミスフォールディングすることはありますが、強発現していたためその可能性は低いと考えています。 この意は、 ミスフォールディングにより封入体形成すると、可溶性画分では得られないはずです。その結果、WBでは可溶性画分には少量(もしくは無し)しか目的タンパク質が検出されないはずですが、自分の実験結果では可溶性画分で高検出できたため、封入体形成はしていないだろう。 ということです。 > 推定アミノ酸配列上に切断を受けるような部位は無くといいますが、それ程当てになるものなんでしょうか。 基本的なプロテアーゼ切断サイトはありませんでした。しかし確かに、確実に切断されていないとは言えませんね・・・。 > 活性測定においてポジコンはつかってますか? はい。また、測定条件に関しては複数あるアイソフォーム全てにおいて最大活性を得られており、特異的な条件が存在しているとは考えにくいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.875-6 - 2012/08/28 (火) 08:17:39 - azara ＞ンンノさん > Sfの系だとウィルスが増える過程でデリーションミュータントが出来て、 プラーク精製をしてもタンパク質発現のための感染時にデリーションミュータントが出来てしまうのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.875-5 - 2012/08/28 (火) 02:19:20 - おお ちょっと興味本位ですが、c末が削れて活性が消失する事が明らかになってますか?

(無題) 削除/引用 No.875-4 - 2012/08/28 (火) 01:28:14 - おお 結論がでませんが、何回か違うコンスストラクトなどもつかってやってるようですので、アクシデンタルな遺伝子の削れでないかもしれません。しかしこれも完全に否定できるわけではありません。発現時に細胞が増えにくくなるとかあれば削れる可能せいは高いですね。

(無題) 削除/引用 No.875-3 - 2012/08/28 (火) 01:22:43 - おお >[Re:1] azaraさんは書きました : > > 昆虫細胞であっても過剰発現によりミスフォールディングすることはありますが、強発現していたためその可能性は低いと考えています。 この事がどう言うことなのかよく分かりません。強発現なので過剰に発現しているとおもったのですが。過剰よりも弱いから強と言っているのですか?それなら過剰と強の区別はどうやってしているのですか。発現が弱いほどアグリケーションやミスフォールディングなどの可能性が少ないとおもいますが、その可能性を排除するほかの根拠があるのですか。排除して良いものなのか慎重に考える必要がないのかということです。 >分子量が推定分子量より小さい 推定は推定であって当てにならないと思います。そのタンパクのendogenousで発現してりるものは実測でどうなのかインフォメーションが欲しくないですが(生物種はぞんじあげませんが、、、)。 > C末端側に何かしらの原因があるのではないかと思っています。しかしながら、推定アミノ酸配列上に切断を受けるような部位は無く、またcDNA上にも予期せぬSTOPコドンの挿入が無い事を確認しております。 推定アミノ酸配列上に切断を受けるような部位は無くといいますが、それ程当てになるものなんでしょうか。 活性測定においてポジコンはつかってますか?

(無題) 削除/引用 No.875-2 - 2012/08/27 (月) 19:36:58 - ンンノ Sfの系だとウィルスが増える過程でデリーションミュータントが出来て、 それが選択的に増えてしまうことがあるようです。

発現と酵素活性 削除/引用 No.875-1 - 2012/08/27 (月) 19:30:57 - azara いつもお世話になっております。 とある酵素の組み換え体（N末端にHisタグ付加）をSf21細胞を用いて作製しました。 細胞を回収後、適当な緩衝液で懸濁・破砕後、上澄みを特異抗体でWBし、強発現していることを確認しました。しかしながら、その組み換え体に酵素活性が全くありません。 昆虫細胞であっても過剰発現によりミスフォールディングすることはありますが、強発現していたためその可能性は低いと考えています。 N末端側に付加したHisタグが原因となっていると考えましたが、タグ無しでも同様の結果を得ています。 また、SDS-PAGE上でですが、その分子量が推定分子量より小さいのも原因の一つではないかと考えました。抗Hisタグ抗体でのWBでその組み換え体を検出でき、特異的抗体は全配列の中間に作製したため、C末端側に何かしらの原因があるのではないかと思っています。しかしながら、推定アミノ酸配列上に切断を受けるような部位は無く、またcDNA上にも予期せぬSTOPコドンの挿入が無い事を確認しております。 そこで、似たような事例や論文をご存じの方がいましたら、教えていただけないでしょうか。宜しくお願い致します。

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