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皆さまありがとうございました 削除/引用 No.8742-10 - 2020/04/11 (土) 23:27:27 - BlueComma 流しの研究者様 丁寧なご回答ありがとうございました。PCRやシーケンシングのエラー、たしかに用心して確認したほうが良さそうですね。「レポーター」と言う語用も納得しました。 回答してくださった皆さま、時間を割いて頂きありがとうございました。実験のトラブルシューティングについて、大変有意義なコメントを得ることができました。解決済みとさせて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.8742-9 - 2020/04/11 (土) 16:00:55 - 流しの研究者 ＞やはり「フレームがあっているか」が最優先なのですね。これを検証する方法として思いつくのは「+1, +2のフレームでコンストラクトを作り直す」ですが、かなり時間が掛かってしまうと思います。もっと効率よく遺伝子のフレームを確かめる方法はありますか？ 当然やっていると思いますが、発現コンストラクトの当該領域をサンガーシークエンスしたデータを、コーヒーでも飲みながら、心を落ち着けて、再確認です。全長をPCRで作成しているのであれば、全長のシークエンスの確認はされていますか？一昔まえ（以上？）に比べると、fidelityは格段に上昇していますが、やはりPCRエラーや合成オリゴのエラーはあります。また、「+1, +2のフレームでコンストラクトを作り直す」は、検証とは言えないです。やり直しですよね。周囲に適切な指導者がいないのでしょうか。 ＞ところで、「レポーター」という言葉が気になる、というのはどういうことなのでしょうか？間違った表現があればご指摘いただければありがたいです。 プロモーター下流に、当該遺伝子の代わりにレポーター遺伝子（例えばGFP)を入れて、遺伝子発現（というかプロモーター活性）を評価する場合は、レポーターという表現がしっくりきます。 質問者様のように、当該遺伝子とのfusion proteinにしたら、当該遺伝子産物の翻訳後修飾等の影響を受けるため、プロモーターの活性をレポートする目的には不適当であるため、レポーターとは呼ぶのは憚られます。この場合は、「タグをつけた」蛋白質を、当該遺伝子のプロモーターを使用して発現、ということになろうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.8742-8 - 2020/03/30 (月) 15:26:51 - かに 私は、その様な話を聞いた場合は、とりあえずまず前提であるところの「CDSはRT-PCRで発現していることを確認できる」を疑います。 どの様に強制発現しているか分かりませんが、仮にプラスミドのトランスフェクションだとすると、RNA調製の際にプラスミドが混ざってくるのはよくあることなので。 まあ、適切なコントロールであるところの、RT-をとっていて、それで「CDSはRT-PCRで発現していることを確認できる」と言えるのであれば、ここはスキップします。 その次には、1)が対処しやすそうなので、1)を消します。 （と言うか、RT-PCRの段階で、GFPもしくは、CDSとGFPを跨いだprimerでRT-PCRをやれば1)が対処できているのでは？） の様に、もうすでに物が有って時間がかからないものをとりあえずやりつつ、コンストラクトの見直しですかね。

(無題) 削除/引用 No.8742-7 - 2020/03/30 (月) 14:41:58 - BlueComma 流しの研究者様 コメントありがとうございます。 やはり「フレームがあっているか」が最優先なのですね。これを検証する方法として思いつくのは「+1, +2のフレームでコンストラクトを作り直す」ですが、かなり時間が掛かってしまうと思います。もっと効率よく遺伝子のフレームを確かめる方法はありますか？ ところで、「レポーター」という言葉が気になる、というのはどういうことなのでしょうか？間違った表現があればご指摘いただければありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.8742-6 - 2020/03/30 (月) 14:07:56 - 流しの研究者 ＞ レポーター遺伝子を配置させたコンストラクト（e.g. [A]pro::[A]CDS-GFP） レポーターという言葉が気になります。 CDS-GFPは、in-frameでfusionしていますか？ しているのであれば、fusion proteinの発現ですよね。 RT-PCRとGFP発現ですので、そもそもRNAは出来ていて、GFPが出来ていないということですから、蛋白質（特にGFP)が作れないということですね。frameが大丈夫か確認、というのがまずやることです。 わざわざ書く必要はないと思いますが、in frameでつながってなければ、真核生物では発現しない可能性がとても高いですね。レポーターと言われるので、気になりますが。。。

(無題) 削除/引用 No.8742-5 - 2020/03/30 (月) 12:39:23 - BlueComma おお様、TS様 コメントありがとうございました。大変勉強になります。 TS様の仰る通り、トラブルシューティングのやりようは様々あるし、最終的には考えうるすべての可能性を検証すべきだと思います。ところが実際にやろうとすると、時間・物資等のリソースには限りがあるわけで・・・このトピック、「皆さまはどういう優先順位でトラブルシュートするか」という意思決定に興味があって投稿しました。 あくまで思考実験として「自分なら先ず〇〇を見て、ダメなら次は〇〇〜」という感じでコメント頂ければと思います。また、「大体こういうときは〇〇が原因」とか「この作業には時間が掛かるので早めに確認しておく」など経験知に基づくコメントがあると尚ありがたいです。 回りくどいトピックで大変恐縮ですが、何卒よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.8742-4 - 2020/03/30 (月) 10:36:09 - おお もし片方のあれるがノックインされず残っているならば、その蛋白特異的な抗体でWBするといいかと思います。理想的にはGFPでタグが入ったものと、そうでないものがほぼ同じ発現量になる（細かくはそうとも言えない理屈もあるでしょうけど）だろうということで。 ＞2)　本当はCDSが正しくない（フレームシフトが起きてしまっている） これで気になるのは意図しないスプライシングが起きてしまっているということでしょうか。全長をPCRで拾えれば見当がつくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8742-3 - 2020/03/30 (月) 09:55:29 - TS どっちのほうがもっともらしいか、の質問はあまり意味がないように思えますが、RT-PCRで一応確認しているということなので、どっちかといえばフレームシフト？ とりあえずポジコンなんかをきちんとおいて、抗体を使ったWBかIFでもしてみては？ PromoterとCDSを別々にワークするかどうかを試すとか、トラブルシュートする方法はいろいろある。

(無題) 削除/引用 No.8742-2 - 2020/03/30 (月) 09:22:10 - おお 細かくはいまかけませんけど、発現制御に問題がないがその発現量では検出感度にいたらない可能性はあるのかもしれません。GFPは固定によわく、固定後検出が難しいのでわざわざ抗体を使うこともあります。

レポーターアッセイのトラブルシューティング 削除/引用 No.8742-1 - 2020/03/30 (月) 01:08:30 - BlueComma いつも勉強させていただいております。 ある遺伝子（[A]とする）のプロモーター領域とCDSの直後にレポーター遺伝子を配置させたコンストラクト（e.g. [A]pro::[A]CDS-GFP）を形質転換したと仮定します。 [A]CDSはRT-PCRで発現していることを確認できるけれども、レポーターを観察するとネガティブだった場合、レポーターを検出できない理由として真っ先に考えられるのは何でしょうか？ 理由は色々考えられると思いますが、例えば以下の2点を考えるとき、どちらのほうが「尤もらしい」と感じるでしょうか？ 1)　プロモーター領域が不完全で導入したコンストラクトの方は発現していない 2)　本当はCDSが正しくない（フレームシフトが起きてしまっている） トラブルシューティングについて、体験談などがあれば尚ありがたいです。何卒よろしくお願いします。

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