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(無題) 削除/引用 No.8716-10 - 2020/03/12 (木) 14:16:34 - AP さらに言えば、スキムミルクだってBSAだって色々なメーカー、ブランド、グレードがあるわけで、 このBSAはokだったけど、このBSAではうまくいかないなんてことも起こりうる。 たとえ世の中的にこれがおすすめというブロッキング剤があったとしても、あなたがまさに使おうとしている製品がうまく働くかどうかはわからない。実際にやってみるしかないのだ。

(無題) 削除/引用 No.8716-9 - 2020/03/12 (木) 10:21:36 - AP どんな抗体であれ、実際にやらなければ、ブロッキング剤の適不適はわかりません。抗原も抗体も多種多様で結合様式から解離係数からみんな違うんですから。 予めブロッキングの適不適に関する情報がなければ、大体の抗体で使えて、安価で取り扱いも容易なスキムミルクでやるのをルーチンとしてまずやる、もし問題があったら他のブロッキング剤を検討する、という進め方が多いんじゃないか。

(無題) 削除/引用 No.8716-8 - 2020/03/12 (木) 09:15:21 - TS 結局ケースバイケースとしか言いようがないですが、 古典的な教科書には、リン酸化タンパク質のブロッキングはBSAが良いとか書いてありますね。でもCSTの抗体は、だいたいMilkでブロッキング、抗体はBSAで希釈となってますね。 個人的な感覚だと、多くの場合、リン酸化タンパクでもMilkでOKだけど、たまにバックが出ることがあるからBSAとかのほうがきれいに出ることがある、位の気がします。

(無題) 削除/引用 No.8716-7 - 2020/03/12 (木) 01:11:48 - おお >目的のタンパクでBSAを使用する事は予想できるものなのでしょうか？ 基本的に考え方が違います。 よほどのことがないときは使っている抗体によると思います。リン酸化部位を認識するような抗体はブロッキングにリン酸化部位がないようなブロッキング剤を使うとか、BSAをキャリアーにした抗原で抗体を作った場合はBSAはブロッキングに使えないとか。 もちろんBSAを検出するような抗体にはブロッキング剤にBSAは使えませんけど。

(無題) 削除/引用 No.8716-6 - 2020/03/11 (水) 22:53:39 - fcvgtbyふい 私もリン酸化部位特異的抗体の時はBSAを（というかskim milk以外を）と習いました。でも最近のいろんなリン酸化部位抗体の実験例やユーザー提供データなど、あるいは論文などを見るとmilkでブロッキングしているのも見かけます。みじかでもmilkでblockingして良好な結果を得てる人はいます。抗体が認識するのはリン酸化アミノ酸残基を含む周辺の数個のアミノ酸残基全体と思うので、多分、多くの抗体はskim milkのリン酸化セリン残基とは識別できるのかもしれないと思います。 当該タンパク質におけるリン酸化formの割合を見るために当該タンパク質の抗体でもウェスタンします。ただウェスタンですので、あまり厳密な定量性はないですが、他に客観的に表現するすべがないのでします。そういうこともあって、実際のところグラフ見なくても（グラフ化するまでもなく）blotを目で見てわかるくらいの差異がないと説得力を持ちません。

(無題) 削除/引用 No.8716-5 - 2020/03/11 (水) 22:39:33 - 初心者+ひろくん ありがとうございます。 スキムミルクでブロッキングしてたのですが、バックグランドが気になる場合などBSAも選択肢にあげていいものかと思ったものです。 目的のタンパクでBSAを使用する事は予想できるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8716-4 - 2020/03/11 (水) 22:25:42 - AP それはリン酸化されたエピトープを認識する抗体で検出する場合。リン酸化を受けるタンパク質でもエピトープがリン酸化と無関係で有れば、考慮の必要はない。 問題になるのは、スキムミルクやその成分であるカゼインでのブロッキング。 カゼインは高度にリン酸化されているので、リン酸化されたエピトープを認識する抗体が交差反応してバックグラウンドを上げてしまう。

(無題) 削除/引用 No.8716-3 - 2020/03/11 (水) 22:23:44 - ふらいむ スキムミルクに含まれるカゼインが高度にリン酸化されたタンパク質であるため、抗リン酸化抗体が結合して実験系を阻害する可能性があるので、代わりにBSAを使うという話でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8716-2 - 2020/03/11 (水) 20:46:03 - 774 リン酸化でカスケードを制御するタンパク質は総量の変化でなくリン酸化体の率の増減を見たいから。

ウエスタンブロッティングのリン酸化たんぱく質 削除/引用 No.8716-1 - 2020/03/11 (水) 20:30:19 - 初心者 ひろくん 初めまして。いつも参考にしてます。 ウエスタンブロッティングをする際、ブロッキング剤の 選択でリン酸化タンパク検出にはBSAなどを使用すると学びました。 検出する目的のタンパク質でリン酸化タンパクかどうかを判断する という事でしょうか？

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