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(無題) 削除/引用 No.8709-10 - 2020/03/08 (日) 21:16:48 - AP agarに含まれるsulfateなんかが酵素を阻害するんじゃなかったな。 agaroseだったら良かったのかも。 最近じゃ安い電気泳動用のagaroseでも問題なくなっているけど、昔はグレードの低いものだとゲル切り出しDNAやin-gelで酵素が効かなくなったりした。 それとは別に、agarose, agarを除去する場合は、クロロフォルムを含まないフェノールの方が効果的。

(無題) 削除/引用 No.8709-9 - 2020/03/08 (日) 15:55:05 - ちき 直接関係ないですが、 昔プラスミドライブラリを扱っていた時、寒天培地上に生えた大腸菌を液体培地等で回収してAlkali/SDS、PCI、エタ沈のみでプラスミドを抽出すると制限酵素で全く切れない、ということを経験しました。一度、シリカカラムを通すと問題なく切れた記憶があります。 また培地用寒天の代わりに、電気泳動用のアガロースでつくった寒天培地を使った場合は問題なく切れました。 粗精製の寒天中に何らかの阻害物質があって、PCI、エタ沈では除けないようです。

(無題) 削除/引用 No.8709-8 - 2020/03/08 (日) 12:59:25 - AP カラムが普及したのは、フェノール、クロロフォルムの使用が忌避される傾向が進んだということもありますかね。それをカラムのメーカーが焚きつけたという面も感じていましたが。 もっとも、DNAの切り貼りやシークエンスくらいならPCI抽出は必要ないですが。

(無題) 削除/引用 No.8709-7 - 2020/03/08 (日) 12:47:03 - AP カラムを使って精製する方法こそ、後から、普及したものです。 Alkali/SDS method なんて基本中の基本で、実験書でも普通に出るでしょ。 市販のキットに依存するのは、コストもさることながら、不自由なもので。 カラムと使い切ったとか、付属試薬のどれかがなくなった、とかで納品されるまで実験をストップしている人を見たことがある。

(無題) 削除/引用 No.8709-6 - 2020/03/08 (日) 12:28:50 - TK-1 transfectionやin vitro transcriptionでもしない限り、カラムなんかいりませんよ。少しの時間をお金で買っているだけです。急がなかったり、そんなにサンプルが多くないのなら、alkaline lysisのsupernatantをisopropanol沈殿したらそれで終わりです。

(無題) 削除/引用 No.8709-5 - 2020/03/08 (日) 11:54:30 - エンドトキシン プラ抽様 >トピックを立てるときに　httpから始まる記述をすると 広告と勘違いされてエラーになります。 返信ありがとうございます。この掲示板の他のトピックでは、普通にhから始まる直リンクが貼られているところもあるので、なぜにh抜きにするのかと思っていたのですが、そういう事情があったのですね。知りませんでした。使用環境の違いによるんでしょうかね？以後、コピペの一手間程度でカリカリせずにいこうと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8709-4 - 2020/03/08 (日) 11:46:53 - プラ抽 >おお様、エンドトキシン様 コメント頂きありがとうございます。 かなり昔から知られていた手法なのですね。 勉強になります。 >エンドトキシン様 トピックを立てるときに　httpから始まる記述をすると 広告と勘違いされてエラーになります。 投稿することができません。 何卒ご了承いただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.8709-3 - 2020/03/08 (日) 11:37:25 - エンドトキシン >シリカにつけるような方法はエンドトキシンの除去が問題になることが多いようですので、細胞によっては更に精製が必要になるでしょう。 まさにこの理由で、ちっとも節約にならん、アホらしいという話がかなり昔にラボで出たことがあります。問題ない場合もあるのかわかりませんが……。 ところで、トピ主はなんで今どき「h抜き」のリンクにしてるんでしょうか？アクセス解析で相手に知られたら不味いのですか？こういう真面目な情報交換掲示板でh抜きにする意味がわからない、ぶっちゃけ余計な手間が増えるのでh入れて直リンクにしてもらった方が楽なのにな、と思うのですが、なにかしら意図があってh抜きにされているのでしょうか？よければ教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.8709-2 - 2020/03/08 (日) 11:00:02 - おお DNAがガラス（シリカ）につくのはよく知られていて、キットはそれを利用して使いやすくしたもの。なのでグラスミルクやグラスフィルターに結合させて精製するのは別に驚くこともないし、論文になるほどのもんかと思うけど。 シリカにつけるような方法はエンドトキシンの除去が問題になることが多いようですので、細胞によっては更に精製が必要になるでしょう。

プラスミド抽出カラムキットを使用しないプラスミド精製法 削除/引用 No.8709-1 - 2020/03/08 (日) 10:41:07 - プラ抽 プラスミド抽出カラムを使用しないプラスミド抽出法がAddgeneのブログで紹介されていました。 試された方はいらっしゃいますでしょうか？ もし宜しければ情報交換させていただけましたら幸いです。 ttps://blog.addgene.org/dna-purification-without-a-kit ttps://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0007750

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