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イオン交換クロマト 削除/引用 No.870-9 - 2012/08/27 (月) 10:35:51 - mon Niカラム精製の条件をいろいろ試すなら、イオン交換カラムのバッチ精製(Trisよりはリン酸バッファ−）での前処理をお薦めします。DEAEセルロースなら安価だしバッファ−交換も不要(optionでイミダゾール添加）でNiカラムへロードできます。

(無題) 削除/引用 No.870-8 - 2012/08/26 (日) 14:54:28 - (゜Д゜ His-tagが蛋白質分子内に埋まってるか、シャペロンみたいな他の分子と複合体作っててそれがアクセスを邪魔してるとか、周辺構造の立体障害っぽいことが原因でニッケルレジンとうまくくっつかないんじゃないかな。普通によくあるよ。実験目的に支障がないならば、変性条件下でやってみたらどうよ。上に書いたようなことが原因ならたぶん上手く行くよ。His-tag 精製なら6M GdnHCl or 8M Ureaがよく使われる。変性作用でプロテアーゼの多くも失活するから分解も抑制出来る利点があるし。

(無題) 削除/引用 No.870-7 - 2012/08/26 (日) 13:22:02 - み みなさんと意見は一致でBinding bufferの濃度が高めですね。 Binding buffer: NaCl濃度300mM, imidazole濃度5mMで大抵上手く行きます。 勿論、ワンステップなら物によっては低分子量化されたものも混入しますが。 個人的にはニッケルよりコバルトの方が精度良いと思うけど今回の問題解決にはつながらないかなあ。

(無題) 削除/引用 No.870-6 - 2012/08/26 (日) 10:28:47 - 笑い男 >合成途中のタンパクの断片ではないかと考えています。 ライセート調製時に分解した訳ではないですよね？プロテアーゼ阻害剤使ってますよね。もちろんEDTA freeで。 わたしも結合時の　�@イミダゾール濃度を下げる、�A塩濃度を下げる、�B金属アフィニティの前に他の精製ステップを挟む　などが思いつきます。 意地でも金属アフィニティで進めるなら、ちょっと還元剤入れたり、グアニジン／尿素など変性剤入れたり、界面活性剤入れたり　するかなー 金属アフィニティゲルのメーカーを変えると、精製結果が大きく変わることもありますよ（もちろん最適な緩衝液は変わってきますが）

(無題) 削除/引用 No.870-5 - 2012/08/26 (日) 05:58:56 - おお いちどNiカラムでスルーしたということは、その溶液には非特異なNiカラムに吸着するタンパクがある程度除けているとおもえば、スルーした物に工夫を加えてNiカラムに吸着させるときれいなものが取れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.870-4 - 2012/08/26 (日) 05:35:51 - おお >実際リコンビナント精製にちょっと型破りだけどまずゲル濾過をかけてします >という、タンパクの結晶をつくる研究室はまあまああるようです。 これはアグリゲーションしているとかの情報がえられるのと、そういうものをまず除くことができるからだそうです。

(無題) 削除/引用 No.870-3 - 2012/08/26 (日) 04:41:13 - おお 一つの考え方として、短い断片が吸着するわけですから、同じ条件なら長いものも吸着しているはずです。でも吸着の具合はイーブンではなさそうだということですよね。 もう一つ考慮に入れるとすれば、お使いのものでどれだけの吸着のキャパシティーがありますか?得られた短い断片がそのキャパシティーより10分の1とかだと、コンペティッションがかかっているとは考えにくいですよね。 Hisの部分がフォールディングにより隠れてしまっている。アグリゲーションなどでHisの部分が隠れてしまっている可能性もあるかと思いました。 実際リコンビナント精製にちょっと型破りだけどまずゲル濾過をかけてしますという、タンパクの結晶をつくる研究室はまあまああるようです。 解決法はすぐ思いつくのは塩濃度をあげるとか、弱いカオトロピック作用をもつLiCl1M以上を使ってみるとか。2MぐらいまでのUreaだと破壊的な変成は起こりにくいという人もいます。もう一つはシンプルに何かデタージェントを使うというのも考えられるかと思います。 ちなみにLiClは燐酸バッファーと相性がわるいです。 あ、いま条件をちらっと見ましたがバインディングの条件でイミダゾールがはいってますよね。基本的に入れる方がきれいになるといわれてますので間違えと指摘するわけではないですが、イミダゾールを下げるかなくしてしまうと弱い相互作用の物もひっかけられます。 それで精製後得られるものが汚い可能せいはありますが、イミダゾールグラジェントをかけるとどの濃度で出てくるか分かりますし、その濃度を基準に得られたものを再度Niカラムにかけてきれいにする手はあります。もちろんNiカラムにこだわらなくてよく溶出物をイオン交換やゲル濾過で精製する手はあります。

(無題) 削除/引用 No.870-2 - 2012/08/26 (日) 00:58:59 - とみー binding bufferで塩の濃度が500 mMというのはやや高めですよね、というのがちょっと気になる点です。私は150 mMくらいでbindさせています。 イオン交換を直前に挟むと、Hisを持ってる短いproteinsなどと目的のものをわけられるかもしれませんね。

Hisタグ融合タンパクの精製 削除/引用 No.870-1 - 2012/08/26 (日) 00:47:38 - mukku お世話になっております。 現在、TAKARAのpCold発現系を用いてHisタグ融合タンパク（N末にタグ）を精製しています。 IPTGで発現確認もでき可溶化できているので大量培養して目的タンパクをGEのNi Sepharose 6 Fast Flowを用いてアフィニティー精製を行いました。 しかし、担体(0.5ml)への吸着が甘いのか素通り画分に多く残ってしまいます。 また、溶出画分に目的タンパクより短いバンドがいくつか見られ、それらを抗His抗体でウェスタンブロットしたところ検出される状態で、合成途中のタンパクの断片ではないかと考えています。これらのタンパクが吸着するために目的タンパクの吸着量が少ないとも考えています。 精製度を上げるためにどうしたらよいか、何かアドバイス等ありましたらよろしくお願い致します。 Binding buffer(pH7.4) 20mM Sodium Phosphate 500mM NaCl 20mM Imidazole Elution buffer(pH7.4) 20mM Sodium Phosphate 500mM NaCl 500mM Imidazole ・やったこと 担体とライセートとのインキュベート時間（１時間〜24時間） wash時のイミダゾール濃度を振って目的外のタンパクの除去 とりあえずは今まで250mL培養分だったこともあり、1Lまで増やしてみようと考えています。

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