BioTechnicalフォーラム [ウエスタンブロッティングの撮影時間に関しまして]

ウエスタンブロッティングの撮影時間に関しまして

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No.8699-TOPIC - 2020/03/04 (水) 01:19:11 - kon

失礼します。ウエスタンブロッティングの撮影で好感度の化学発光試薬を用いて、撮影時間が30分～1時間くらいでバンドが見えてくるなどということはありますでしょうか？
　

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No.8699-9 - 2020/03/05 (木) 09:37:56 - asan

オートラでの焼き付けなら、時間経過で結構感度が上がる場合もあるとは思いますけど、昨今のCCDカメラの場合は長時間露光しすぎると逆に電子的なノイズも増えますし、感覚的には30分ぐらいが限界なのではないかと思います。もちろんECLの反応の問題もありますしね。

10分焼いて全く見えなかったら、単純にS/Nの問題なので、ローディング量を上げるとか抗体濃度をあげてみるほうが現実的には有効だと思います。それでノイズがですぎるなら多分長時間焼いてもノイズでダメだともいます。

duraとか使ってるならELCのfemtoとか使ってみると改善する場合もありますが、結構値段がたかいですがね。

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No.8699-8 - 2020/03/05 (木) 02:25:34 - おお

>露光時間長くするほど他のバンドが出てしまい本当に、
>目的のバンドか怪しく感じたときはポジコンの設定で
>解決するのでしょうか？

できればネガコンがほしいところではあります。
あとはWB以外の実験で多角的にみるとか、複数の抗体を使うとか、場合によってはIPもやりようがあるでしょう。

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No.8699-7 - 2020/03/04 (水) 22:09:44 - AP

peroxidaseによるルミノール発光は基本的には発光寿命が短い。
これは反応を触媒するのと引き換えに活性が急速に低下るので（おそらく自ら発生するラジカルのために）酵素の寿命が短い。
反応開始直後にぐんと立ち上がり、急速に減衰するので露光時間を伸ばしても効果が得られない。

ただし、最近は反応液をいろいろモディファイした製品があって、酵素活性の低下を防ぎ、長時間反応できるものなどが出ている(duraだのprimeだの）。そういう製品を使っているなら露光時間の延長は大いに効果が期待できる。

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No.8699-6 - 2020/03/04 (水) 20:08:08 - 1

評判まではいちいち気にしていないので好感度が良いのかどうかわかりませんが高感度のECLは使ってます。30minくらいでようやく見えるのもたまにあるのでそういうのもあると思います。分子量などから推察してみたいものである可能性ありそうならばアプライするタンパク質量を何倍かまで増やして再実験します。

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No.8699-5 - 2020/03/04 (水) 19:20:01 - まず

使ってる試薬とWBの目的がわからないと何とも言えないのでは
化学系ってことは現像じゃなくて可視バンドか蛍光で撮影（スキャン）してる印象だけど
濃度振って強弱を見たいんじゃなくて
有るか無いかでバックが邪魔って話なら
単純にバックが出ない時間までにすればいいし
目的のバンドがバックレベルでしか出ないならそれは無いだけなんじゃ

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No.8699-4 - 2020/03/04 (水) 18:05:08 - kon

konです。
貴重なご意見有難うございます。
露光時間長くするほど他のバンドが出てしまい本当に、
目的のバンドか怪しく感じたときはポジコンの設定で
解決するのでしょうか？
分かりづらくすいません

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No.8699-3 - 2020/03/04 (水) 16:51:01 - あべちゃん

発光の持続時間などはメーカーの説明書などにかかれており、露光時間の延長により微量蛋白質を検出できることをうたっていたりします。
https://www.nacalai.co.jp/products/entry/d005010.html

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No.8699-2 - 2020/03/04 (水) 04:12:56 - おお

yes