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(無題) 削除/引用 No.8695-5 - 2020/03/05 (木) 09:38:41 - おお >イントロンがだいぶぶんを占めるのにも関わらず、なんというか途方もない実験なんですね。 興味があるなら調べてみるといいでしょう。実は少し効率に関して仕掛けがありまして、LacZのまえにスプライシングのアクセプターを入れてます。なので上流にプロモーターとそのエクソンがあれば、そのエクソンの下流のイントロンを飛ばしたLacZ配列をもつmRNAができるようになってます。

(無題) 削除/引用 No.8695-4 - 2020/03/05 (木) 09:23:29 - 印加 おお先生 書き込みがないか待っていました。 するととても示唆に富むコメントをくださり、残念な思いだけでなく、一ついや、それ以上知識を得られた嬉しさも抱きました。 ジーントラップは名前は聞いたことはあっても何を意味するものかはわかりませんでしたが、そういうことだったんですね... おお先生の描かれたLacZの組込みですが、これはランダムということですよね。 イントロンがだいぶぶんを占めるのにも関わらず、なんというか途方もない実験なんですね。 大変そうです...。 プラスミドを使わない方法というもので考えてみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8695-3 - 2020/03/05 (木) 05:48:06 - おお おそらくお察しのことが起こっているでしょう。 昔Gene trapといって、プロモーターを持たないLacZをESなどに挿入してLacZが発現する、あるいは分化などの過程でLacZの発現変化が見られるクローンを探し、どんな遺伝子の部位に入ったか確かめ、分化などに関与する遺伝子を突き止めるという方法がありました。

(無題) 削除/引用 No.8695-2 - 2020/03/04 (水) 02:21:50 - 印加 上げさせてくださいm(_ _)m

TOPOベクターの遺伝子導入 削除/引用 No.8695-1 - 2020/03/03 (火) 03:19:38 - 印加 いつも参考にしています。 今、TOPOベクターにCRISPR Cas9でのドナーテンプレートをクローニングしたものを使っています。 このTOPOベクターには、ドナーとピューロマイシン抵抗性遺伝子が乗っており、その二つをIRESで繋いでいます。 これをgRNA/Cas9の乗ったプラスミドと同時に293Tにトランスフェクトし、ピューロで選択しました。 コントロールとして、TOPOドナーテンプレートのみも作製しました。 するとどうでしょう。 TOPOドナーテンプレートのみの方でもコロニーができてきました。 もちろん何もトランスフェクトしなかったコントロールでは293Tは全滅です。 これは哺乳類細胞で働くはずのないTOPOベクターが、どこかの遺伝子のプロモータ等にインテグレートされ、ピューロが発現してしまったと考えるのが筋でしょうか？

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