BioTechnicalフォーラム [安定発現株を取ろうとすると抗生剤耐性なのに取れない。]

安定発現株を取ろうとすると抗生剤耐性なのに取れない。

No.8691-TOPIC - 2020/02/29 (土) 04:20:06 - ぽっぽ

よろしくお願いいたします。

私はHeLa細胞を用いて、ある遺伝子の安定発現細胞を取りたいです。
そこでIRES-EGFPベクターを用いてIRESの前に目的の遺伝子をクローニングしました。

これを一過性にCOS7細胞にて過剰発現させると、EGFPはもちろんのこと、前の遺伝子も強く発現します。
これで安心だと思い、さっそく293T細胞にてレンチウイルスを作製し、これをHeLa細胞に感染させました。
2日後に約10％ほどがEGFP陽性だったので、ソーティングし、約10日間ほどかけて増やしました。

結果、フローサイトメトリーではEGFPは依然として強く見られましたが、IRES前の遺伝子が全く発現していませんでした。こちらはウエスタンブロットにて確認しました。

IRES前の遺伝子はビオチン化酵素との融合タンパク質なのですが、ビオチン化の活性も皆無でした。
一方、コントロールタンパク質とビオチン化酵素との融合タンパク質を安定発現する細胞も並行して作っており、そちらではEGFPも陽性、ウエスタンでもビオチン化酵素との融合タンパク質は発現が確認でき、さらにビオチン化酵素活性も認められました。

以上のことから、私の興味あるタンパク質とビオチン化酵素タンパク質との融合においてどうも積極的なタンパク質分解や機能欠失になっているようです。EGFPはそれでも発現しているので、プロモータのサイレンシング等は考えていません。

どうしたらこの状況を打開できるかずっと考えていますが、行き詰まってしまいここでトピックを立てさせていただきました。コメントをいただけると大変嬉しいです。よろしくお願いします。
　

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No.8691-6 - 2020/02/29 (土) 21:04:17 - そういうことあるよね

EGFR野生型細胞株に対して欠損株を樹立したのですが、その株にEGFP変異型（がんの原因の一つ）をIRES-puroで導入しようとして、取れなかった経験があります。

puro耐性だけは取れました。

自分の解釈としては
１）細胞毒性があるため樹立できなかった
２）kozakはしっかりつけていたが、違う開始コドンを認識したpuro耐性が取れた
３）単に、樹立したシングルクローンが少なかっただけ。もっと取れば取れる日も来るかも・・・？

と、考えました。

今、再実験と同時に、2Aペプチドで実験中です。

同じ結果になるかもしれませんが・・・・。

ご参考まで。

(無題)

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No.8691-5 - 2020/02/29 (土) 10:49:34 - 774

細胞との相性を考えて、
１）HeLaをソーティングする時点での目的遺伝子の発現
２）HeLaにtransientで入れた時の発現
あたりを確認するかな。

(無題)

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No.8691-4 - 2020/02/29 (土) 10:26:55 - おお

>2日後に約10％ほどがEGFP陽性だったので、

タイターが低いのか、発現が増殖、生存に負の効果があるのか、、、

(無題)

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No.8691-3 - 2020/02/29 (土) 07:46:56 - おお

プロモーターをTet onなどの誘導型にしてみる。