お世話になっております。
qPCRでのDuplicateのCt値のばらつきの解決策について、ご相談させていただきたく思います。
そんなん腕が悪いんやろ、と思われると思いますが、ご容赦いただければと思います。
RNAおよびcDNAの扱いの基本的な部分も、念のため再確認させていただきたく思います。
SYBR GreenでDuplicateでActbを検出したところ、0.2程度異なることが度々あります。（他の遺伝子でもばらつきの程度に差はありますが、同様です。なお、ROX補正はない装置で、Dissociation curveは問題なさそうです。）
めったにないのですが、ひどい時には0.6程度異なることがありました。
（96well plateの離れたところだと、Ct値が離れやすい様です。）
せめて0.1以下にはしたいと思っております。（ちなみに、みなさまにとって許容範囲はどの程度ですか？）
思いつく解決策をリストアップしていただけませんでしょうか。
気になっている点や、現状等を下記に列挙します。
ピペットの洗浄は行うつもりでいます。（少なくとも見た目上アプライ量の誤差はなさそうに見えますが、念のため。）
実験台等の空間の清掃はどうしていますでしょうか？（実験台はEtOHで拭いています。RNA用エリアではなく、DNAもタンパクも同じ机で行います。）
qPCR装置が水道の近くで、部屋がたまにハイターのにおいもします。気になりますでしょうか？（Ct値問題に気づいてから、気になりだしました。どこに置くべきか・・・。）
cDNAはVortexしていますか？（私は転倒混和・タッピングで、混和しています。）
PCR時のMixtureの調整やアプライは氷上？or室温？(氷上でやっていますが、知人は常温でおこなっており、あまり重要ではないかと感じています。)
PCR装置のランプは一応期限内（６５０時間。交換目安は８００−１０００時間）。
cDNAは10倍程度に薄めてPCRにかけています。なお逆転写は説明書通り（500ng/10uL)です。
逆転写は8連チューブ（日本ジェネティクスFG-0088WF/SE）を使用して、サーマルサイクラーで行なっています。
qPCRはスタンダードプレート（Fastではない）で、total 18uLにしています。（25uLだと多少は改善しますが、多少・・・。）
試薬は純正ではありません。（Takaraの装置で、ToyoboのSYBRです。安いのを探し回って、今はこれ。安くて評判がいいもの、ご存知でしょうか？）
まとまりのない長文になってしまいましたが、
なんでもお気づきの点がございましたら、
なにとぞよろしくお願いいたします。 |
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