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(無題) 削除/引用 No.8663-9 - 2020/02/28 (金) 11:14:36 - AA 実際には25回分を1本のtracrRNAでは実験出来ないとは思いますが、 それでもかなりの差がでるとは思います。

(無題) 削除/引用 No.8663-8 - 2020/02/28 (金) 09:55:24 - Palms >AAさん 　ありがとうございます。コストが格段に違うんですね。

(無題) 削除/引用 No.8663-7 - 2020/02/28 (金) 09:34:32 - AA 化学合成で作るtracrは結構の収量で届きますので、ターゲットごとに買い換えるのはcr部分だけですみます。 FASMACの場合なら、cr=10000円、tracr=25000円、sg=30000円なので ・cr+tracrの場合 25*10000+25000=275000円 ・sgの場合 25*30000=750000円 と、費用の面で大きな差がでます。 作業そのものについては、どっちのほうが効率が良い、というようなことはないようです。

sgRNA vs crRNA+tracrRNA 削除/引用 No.8663-6 - 2020/02/28 (金) 08:29:08 - Palms >25種類のsgRNAを足し合わせると核酸自体の量がえらいことになります。 　返信が遅れてすみません。また、説明不足ですみません。一つの実験群について、一種類のsgRNAを導入します。実験群の種類が多いということになります。 　勉強するにつれて、また質問が生じてしまい、再び上げさせていただきます。 　FASMACの場合、選択の余地はないようなのですが、業者によっては、sgRNAのみを購入して使う場合と、crRNAとtracrRNAを別個に購入して使う場合があるようです。それぞれの使い分け、長所短所など、もしご存知の方がおられたら教えていただけますでしょうか。 　（ベクターから発現させる場合はsgRNA一択かと思いますが、業者からRNAを買う場合ということで） 　大変恐縮ですが、どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.8663-5 - 2020/02/19 (水) 10:05:01 - AA FASMACは安価で納期も早く、精製も選択肢があるので非常に重宝しています。 ですが、安価とはいえやはりcrRNA1本につき1万円くらいはしますので、 5gRNA/targetで5targetあるとなるとそれだけでかなり掛かることになります。 だいたい50−60ugくらいのスケールで届きますが、例えばエレクトロポレーションの場合、20ulの系に100-200pmol(概算値で1-2ug)くらい必要になりますので結構消耗すると思います。 そのあたり注意されたほうが良いかもしれません。 また、書いていて思いましたが、25種類のsgRNAを足し合わせると核酸自体の量がえらいことになります。 導入方法やそれぞれの比率などよく検討されたほうが良いかもしれません。 U6-sgRNAのカセットがマルチで載ったベクターを作って入れるほうが適しているような気もします。

ありがとうございます 削除/引用 No.8663-4 - 2020/02/19 (水) 00:43:39 - Palms ＞DSCさん 　情報ありがとうございます。外注でできるとのことで安心しました。非常に助かりました。

(無題) 削除/引用 No.8663-3 - 2020/02/18 (火) 10:17:15 - DSC 私のところでも複数のgRNAを並行して導入しなければならなかったのですが、そのようなケースではFASMACのGenomeCraftが便利・経済的でした。 http://fasmac.co.jp/genome_editing_guide_rna tracrRNAを1つ購入すれば、それを様々なcrRNAと対合させて使用することができます。 導入方法に関しては、私はCas9タンパク質と複合体形成させてからLipofectamine CRISPRMaxで入れていたので状況が異なりますが、共同研究先は比較的普通の条件のエレクトロポレーションでかなり効率よく編集できていました。

gRNAの導入方法 削除/引用 No.8663-1 - 2020/02/18 (火) 08:35:15 - Palms 　基本的な質問で恐縮なのですが、ご教授いただけましたら幸いです。 　現在、Cas9を発現するStableの細胞株をすでに持っています。この細胞にｇRNAをあまり手間をかけずに導入したいと考えています。細胞株の種類が2種類、ターゲットの箇所が５〜７か所、そして、特殊な系のため一か所につき５種類のｇRNAを用意しなくてはならず、ｇRNAを発現するベクターを個々に作成するというのを避けたいと考えています。 　業者が合成したｇRNAをトランスフェクションするという方法があることはわかったのですが、この方法は一般的なのか、もしそうならどのようなキットが良いのか等に関しまして、ご教授いただけますでしょうか。 　どうぞよろしくお願いいたします。

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