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(無題) 削除/引用 No.8662-4 - 2020/02/19 (水) 05:24:04 - おお >最終的な蛋白濃度はだいたい１から２mg/mlぐらいであまり濃いと抽出が完全でない可能性も高くなってくる。 >タンパク質濃度は25 mg/mlでした。 ちゃんと読んでいただいているのでしょうか、、、 蛋白濃度が濃いのもバックグランドの強さの原因になっているのかもしれません。またターゲットの局在を利用してエンリッチメントできる抽出方法を考えるとよりスペシフィックにPull downできる可能性があると思う。

(無題) 削除/引用 No.8662-3 - 2020/02/19 (水) 04:23:33 - MS おお先生、ご教授ありがとうございました。 実験を行ったのでアップデートさせてください。 マウス腎臓2つを2 mlのライシスバッファー内にてホモジナイズを行い、その後、16000g、10分遠心。 その上清にはモヤモヤも含まれていたり、上澄みに脂肪のようなものが浮いていたりしたので、上清を新しいチューブに移し、再度遠心しました。その際にもペレットが小さいながら生じており、それを避けて上清を回収しました。 タンパク質濃度は25 mg/mlでした。 トータル2 mlなので、50 mg分のタンパク質が抽出できました。 おお先生のおっしゃる通り、組織重量の10％ほどでした。 その後、10 mg/mlになるように調製し、そこへ300 pmolのFcコントロールもしくはFc融合タンパク質を加え、1時間4度で旋回後、Protein Aアガロースを50 ul更に加え、1時間4度で旋回させました。 その後、ビーズをライシスバッファーで4度洗いました。 最後に2MEを加えた2x SDSバッファーを加え、ボイルし、電気泳動を行い、銀染色をしました。 結果はやはりFcコントロールの法でもたくさんのバンドを認めました。 1つだけ15kDaほどに差のあるバンドは認めました。 ただ、いわゆるトップラボが出すトップジャーナルの図のように、コントロールではレーン全体に渡ってほぼ何も見えず（ただし餌となるコントロールタンパク質は検出されていますが）、融合タンパク質ではいくつかはっきりしたバンドが出る、というデータは得られませんでした。 なぜここまで綺麗な白黒はっきりするデータが得られるんでしょうか... アガロースだと非特異的な吸着があったりするのでしょうか... NHS-Activated Agaroseなんかを用いたら、Fcタンパク質はビーズに共有結合するでしょうから、結果に改善が見られるのか等、考えています。 もし引き続きアドバイスをいただけるようでしたら、お願いできませんでしょうか。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.8662-2 - 2020/02/18 (火) 07:24:33 - おお 蛋白や何をするかにより、Lysis bufferをどうするかは方法論的に幅があると思います。なので一般的というのはないことはないですが、それぞれより良い方法論を見つけるほうがいいかと思います。 目安として組織の重量の１０％ぐらいが蛋白（実際もう少しすくないかもしれない、また筋肉などでは２０％ぐらいになるかもしれません）、最終的な蛋白濃度はだいたい１から２mg/mlぐらいであまり濃いと抽出が完全でない可能性も高くなってくる。 これに基づくと「腎臓が0.2 mgほどあれば、1％　TritonX100を2 ml」は結構薄いですが、対象蛋白の発現量などが高いならそれもありかもしれません。またTritonX100単独の抽出力を考えるとこれぐらいの量が必要なのかもしれません。 予備実験でいいコンディションを見つるのがいいかと思いますが。 Webで検索してもいくらかProtocolやSuggestionが見られますのでそういうのも見ながら一般的と言ってもどれくらい幅があるかなど見てみると良いでしょう。それらを見る上でこのようなプロトコールは一般的、または蛋白発現が見れるようにより幅広い蛋白が確実に抽出されるような観点でデザインされていますが、特定の蛋白を見る場合その蛋白が効率よく抽出されて他の蛋白はそうでなくていいこともおおいのでそういう視点も考慮したほうがいいかもしれません。 usbio.net/protocols/tissue-lysates-preparation abcam.com/protocols/sample-preparation-for-western-blot phosphosolutions.com/protocols-lysate-preparation/ ptglab.com/media/2724/protocols-for-web_lysate-preparation_v3.pdf

結合タンパク質同定目的のための組織抽出液の界面活性剤濃度 削除/引用 No.8662-1 - 2020/02/18 (火) 03:40:25 - MS 結合タンパク質同定目的のための組織抽出液の界面活性剤濃度について相談させてください。 今、Fc融合タンパク質にてマウス組織からプルダウンを行い、結合タンパク質を同定したいです。 そこでマウス腎臓の組織抽出液を作りたいのですが、その際のライシスバッファーのボリュームをどれほど持ちいればいいのかわかりません。 十分に可溶化するために、例えば腎臓が0.2 mgほどあれば、1％　TritonX100を2 mlほどあれば十分でしょうか？その後、ダウンシングホモジナイザーで破砕し、16000g、10分で遠心した上清からプルダウンを行いたいです。 ただ、2 mlの根拠は論文から得たヒントで、これで十分か、あるいはもっと一般的なコンセンサスがあるのか知りたいです。どうかよろしくお願いします。

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