BioTechnicalフォーラム [KOマウスのgenotypeとrealtimePCR結果]

KOマウスのgenotypeとrealtimePCR結果

No.8660-TOPIC - 2020/02/17 (月) 21:46:14 - あおむし

ノックアウトマウスを作製し、Characterを確認しております。
5'開始コドンから20base目～11base Deletionのノックアウトマウスを作製、
ゲノムシークエンスと電気泳動でホモは設計通り11base欠損が確認できています。
それらマウスのrealtimePCRを行ったのですが、目的遺伝子のmRNAバンドが
野生型と同様に検出されてしまいます。

ちなみに11baseですのでフレームシフトは起きないはず、
定形外翻訳を行う可能性のあるATGはずっと下流で、
使用しているrealtimePCRプライマーで出される領域で
翻訳が起きているとは思えません。
プライマーの特異性はこの分子のmRNAに特異的です。

シークエンスでゲノム配列（エクソン）の欠損が
確認できているのに、mRNAが正常に発現する
（つまり分子は出来ている？）ということは
起こりうるのでしょうか。

それともrealtimePCRのプライマー温度条件設定などを
再度行い、より至適な条件を検討すべきでしょうか。
　

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(無題)

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No.8660-13 - 2020/02/24 (月) 06:41:25 - おお

１１ベースの欠損が見れるプライマーでｑPCRしたりしているのならPAGEで長さを調べれば、３０分もあれば結論がつきますが、、、

そもそもゲノムの確認が出来ていてRNAを確認する理由は何ですか？

>おお様、AA様

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No.8660-12 - 2020/02/23 (日) 20:58:00 - あおむし

貴重なご意見をありがとうございました。

2000年から2010年頃のネオマイシンカセットでエクソンをごっそり入れ替えて
作成していたノックアウトマウスの時代ではNorthern blotで完全にmRNAがなくなってる、といったデータが載った論文などありますが、今回我々のはゲノム編集でフレームシフトが起こらないよう３の倍数でない塩基数でエクソン内をDeletionしたのみで、実はどのように転写・翻訳が起こっているのかよくわかりませんし、Non-coding RNAが存在する可能性がありますよね。

qPCR産物の配列を読むことで少しは解決するかと思いますので、
それで進めて確認してみますが、このように
mRNA発現自体はDeletionで何ら変化ないように一見見える
（Non-coding RNAやPseudogeneなど）というようなことは
ゲノム編集マウスでは頻繁にあることなのでしょうか。

(無題)

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No.8660-11 - 2020/02/19 (水) 09:54:44 - AA

qPCRしているなら産物をクローニングして読んで見れば、11bp delのmRNAが存在するのかどうかすぐに分かるのでは無いでしょうか。

(無題)

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No.8660-10 - 2020/02/19 (水) 02:15:30 - おお

>mRNAがNMDでなくなると思っておりました

正確にいうと。mRNAがNMDでなくなる可能性がある。
最近はフォローしてませんがNMDが起こる条件など探られていました。Premature stop codonの位置にも依存したりしていますし、それは実験で使ったモデルでの実験です。Non-coding RNAが分解されないで存在したり、場合によればPseudogeneの発現が観察されたりもしますので、蛋白をコードできないであろうRNA＝分解というのは成り立たないと言えます。

回答を有難う御座いました。

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No.8660-9 - 2020/02/18 (火) 21:24:37 - あおむし

皆様早々にアドバイスを頂きまして、有難う御座いました。

AP様
>realtime PCRではバンドを観察できたはずないと思うけど。
>内部欠失なら翻訳が起ころうと起るまいと、フレームシフトがあろうとなかろうと(11 bp 欠失ならあるわけだけど)、転写は起こる。
>転写と翻訳を混同しているようにしか思えないのだけれど
11baseですのでフレームシフトが起こり、20aaほど後ろでストップコドンが出来る設計です。
ですので転写レベルでNMDによりrealtime PCRではバンドを観察できたはずないと思いましたが見られたので、なぜかと思いまして、質問をさせていただきました。

あの様
>RTPCRで増えてきたものをクローニングかダイレクトクローニングして11塩基>欠失があるか確かめること
RTPCR産物が11塩基欠損であることを確かめればよいのですね。転写レベルで11塩基欠損していることを確認してみます。
ありがとうございました。

おお様
あの様からもコメント頂きましたように11塩基欠損のmRNA配列であることを確認してみます。本分子は良い抗体がなく本マウスを抗体バリデーションに使用予定でした。cKOではありません。11塩基欠損(エクソン内配列)はTail ExtractのPCR産物のシークエンスとアクリルアミドゲル電気泳動で確認しています。mRNAがNMDでなくなると思っておりましたのでrealtime PCRでWTとKOで区別できると思っておりましたがバンドが出てきたので不思議に思いましたが
転写は起こり11欠損のmRNAが生じると考えてみます。

ちき様
3の倍数の塩基欠損ですとmRNAは転写されると考えておりましたが11塩基欠損で、その後ストップコドンを生じるため、NMDでmRNAのバンドは出ないと考えておりましたがバンドが出てきてお尋ねしました。11塩基欠損のmRNAが発現すると考えられるのですね、RTPCR産物の配列を確認してみます。

皆様、有難う御座いました。

(無題)

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No.8660-8 - 2020/02/18 (火) 08:58:00 - ちき

教科書的な理解では、フレームシフトがあればNMDでmessageは分解されると思います。フレームシフトがなければ正常量の変異messageが検出されて不思議はないでしょう。

(無題)

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No.8660-7 - 2020/02/18 (火) 03:25:34 - おお

もう一つは、あるかないか、欠失しているかどうかを判定するのにわざわざqPCRをするのも最近では普通なのですか？PCRしてゲルで流すにしても系がうまく働かなくて混乱してしまうケースはしばしばあると思えるのに。

(無題)

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No.8660-6 - 2020/02/18 (火) 03:21:55 - おお

蛋白をみればmRNAレベルでの検出系でのトラブルで足をすくわれることはないと思いますが、最近は必ずmRNAレベルでの確認をしているのですか？

で正確な理解のため確認しますが、コンディショなるKOではないですよね。

(無題)

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No.8660-5 - 2020/02/18 (火) 03:03:25 - あの

RTPCRで増えてきたものをクローニングかダイレクトクローニングして11塩基欠失があるか確かめることと、11塩基欠失ではフレームシフトは起きる”はず”だからね。

(無題)

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No.8660-4 - 2020/02/18 (火) 02:21:40 - おお

>目的遺伝子のmRNAバンドが野生型と同様に検出されてしまいます。

11base欠損のmRNAが検出されてませんか？

(無題)

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No.8660-3 - 2020/02/17 (月) 23:06:02 - AP

realtime PCRではバンドを観察できたはずないと思うけど。

内部欠失なら翻訳が起ころうと起るまいと、フレームシフトがあろうとなかろうと(
11 bp 欠失ならあるわけだけど)、転写は起こる。11 bp 欠失なら普通の電気泳動では区別は出来ないし。

転写と翻訳を混同しているようにしか思えないのだけれど、私は何か誤解しているのだろうか？

KOマウスのgenotypeとrealtimePCR結果

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No.8660-1 - 2020/02/17 (月) 21:46:14 - あおむし

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