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(無題) 削除/引用 No.8653-14 - 2020/02/22 (土) 04:41:37 - JM asanさん 標的ペプチドに絞って、同位体ラベルのコントロールを購入して定量コントロール（スタンダード）にするという感じでしょうか。なんとなくイメージできる気がしてきました。 SDS-PAGEで切り出してin gel digestion、ポジコン（強制発現）とネガコン（ノックアウト）の準備はできると思うので、core facilityと相談してみます。どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8653-13 - 2020/02/20 (木) 18:29:42 - asan （１）DIAというのはdata independent acquisitionの略で良いでしょうか？ そうです。 　 （２）安定同位体コントロール（ペプチド・プロテイン　ライブラリ？）というのは、自分で準備するものなのか、あるいはcore facilityや外注で頼めば、ポジコンの細胞（ライセート）から作ってもらえるものなのでしょうか？　 安定同位体の入ったものならばAqua　peptideとして売ってるので通常のペプチド合成＋aぐらいの費用です。ただ、どんなペプチドでも検出できるか？というわけではないので、どのペプチドを定量するかを選ぶための事前情報が必要になります。 （３）SILACとかTMTとかはちょっと聞いた事があるのですが、定量原理的にはDIA解析定量も同じような感じなのでしょうか？ Aquaの代わりにTMTやmTRAQなどの試薬でラベルして定量する方法もあります。原理は似てますが、通常のSILACやTMTは代謝ラベルで大規模定量する場合ですが、限られたペプチドを当てに行くので感度と定量性が違います。 （４）普通のmass spec facilityでもできる可能性があるなら、大学のcore facilityでちょっと聞いてみようと思うのですが、素人考えでしょうか？ 何よりも、協力してもらえる可能性のある人に聞いてみるのが早いと思います。ただ、コアに専門家がいないと難しいかもしれません。 Detection and Quantitation of Circulating Human Irisin by Tandem Mass Spectrometry Cell metabolism 2015 などの論文を参考にしてもらえば、何を言ってるのかわかると思います。この場合はplasma中のペプチドの存在の有無について議論があったことでそれを証明してるわけです。 ただし、いくら感度をあげるといっても、whole lysatesでは核タンパク質とかどうしても見えにくいタンパク質はあったりします。やるなら、SDS pageで銀染色後、存在すると推定される分子量付近を切り出してin gel 消化後のサンプルでポジコンネガコン、サンプルなどを置いてやれるかどうかだともいます。 ただし、リバイス中なら、そこまでこだわる必然性があるかどうかってところですけどね。IFの高いジャーナルなら存在しない（か少ないこと）にこだわるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.8653-12 - 2020/02/19 (水) 11:25:49 - JM asanさん、どうもありがとうございます。質量分析の知識があまりないので、何点か教えて頂けませんでしょうか？　安直ですいません。 （１）DIAというのはdata independent acquisitionの略で良いでしょうか？　 （２）安定同位体コントロール（ペプチド・プロテイン　ライブラリ？）というのは、自分で準備するものなのか、あるいはcore facilityや外注で頼めば、ポジコンの細胞（ライセート）から作ってもらえるものなのでしょうか？　 （３）SILACとかTMTとかはちょっと聞いた事があるのですが、定量原理的にはDIA解析定量も同じような感じなのでしょうか？ （４）普通のmass spec facilityでもできる可能性があるなら、大学のcore facilityでちょっと聞いてみようと思うのですが、素人考えでしょうか？ qRTPCRの結果は初回投稿原稿に入っており、陽性細胞の1/100から1/1000くらいのレベルで検出されます。なのでトランスクリプトが存在するのは確かですので、タンパクも微量で存在する可能性が高いです。おおさんやasanさんのアドバイスを参考にして、overstateにならないよう気をつけた書き方に改めてみます。

(無題) 削除/引用 No.8653-11 - 2020/02/19 (水) 10:01:21 - asan （１）ウエスタンと比べて蛍光免疫染色・共焦点顕微鏡観察の方が感度が高いと一般化できるのか否か？ 一般論なら、ウエスタンの方が検出感度及びS/Nの感度は高いと思います。 ただし、ウエスタンはその可溶化条件や抗体の染色の仕方によって変わると言われたらそれも真実かと思います。何れにせよ、定性的なものだと思います。 厳密に定量するなら、質量分析でDIAをやって安定同位体のコントロールと同時に流して該当するペプチドの定量値がゼロ（または検出以下）などの議論をするのが一番定量性としては高いと思います。低分子などの場合の検出と同じ理論をペプチドの定量に用いる方法ですが、低分子に比べてやるのは簡単ではないです。 （２）ウエスタンで陰性の細胞において、免疫染色で陽性シグナルが見られた場合、非特異染色の可能性を否定できず、データにできないのではないか？ 蛍光染色は局在情報が付与されるので、特定の場所に局在して機能するタンパクの場合はその発現がたしかにポジコンと比べて見えない、という出し方ができればより説得力はあるかもしれません。ただし、定量性や抗体の特異性（バックグラウンドの有無）としては、WBの方がはるかに感度もいいし、現実的だと思います。感度としてはqPCRが一番いいと思いますが、見てるものはタンパクではないですね。 （３）ノックアウトの細胞をネガコン、過剰発現した細胞をポジコンとして免疫染色の条件設定を行い、その条件で共焦点顕微鏡観察した結果が陰性の場合、それで陰性と結論できるのか？ 「陰性」と結論づけるかどうかは結局哲学的な問題なので、あくまで「ポジコンに比べて検出感度以下か、ほぼ存在しないレベル」という表現の仕方でいいと思います。ただ、出てるか否かということが論文の趣旨に大きく影響するなら、1つや2つのアプローチで示すだけでは不十分という指摘と捉えるならば複数の観点で観察結果が一貫してることを示さないと納得してくれない可能性はあるでしょう。 今回の指摘がどうかなんともいえませんが、peer reviewプロセスも所詮は人がやることですからそれぞれの経験、専門分野や研究アプローチ、テーマの利益相反などによって主観的な主張をされることはあるのであまり細かい指摘にとらわれすぎずに大枠として一貫した生産性のあるリバイスができれば問題ないと思います。単に免疫染色しろ、というだけの話ならば大して手間出なければやればいいし、やってもいまいちなら、「抗体の特異性の問題でバックグラウンドがあるため綺麗な差が見れないが、我々の主張はWBでノックアウトをポジコンと比べてほとんど検出できていないし、mRNAの発現量もそれを支持してる。ただ、minimal levelで発現してないという表現は科学的に誤解を生むので、under detection levelなどの表現に言い換える。」とか返答するなどすればそれ以上の突っ込んだところで相手も言いがかりになるだけでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8653-10 - 2020/02/19 (水) 07:33:30 - JM Palmsさん コメントありがとうございます。コンフォーカルを初めて習った時に、技術指導者の方から「シグナルの飽和を可能な限り避けるように」と言われており、その条件で一回は撮影するようにしてます。その上で、必要であれば条件を変えて見るようにしています。どのような条件でも、ポジコンとネガコンを同一条件で撮影しておけば、評価は可能と思っています。 ポジコンと言っても、非生理的なレベルで過剰発現している訳ではありません。生理的な範囲内で発現していても、そのシグナルが飽和しないレベルで合わせてしまうと、弱いシグナルは失われてしまう事があり得る（顕微鏡のダイナミックレンジが自然界のレンジをカバーできていない）という事と理解しています。ウエスタンでも、ポジコンのシグナルの飽和を避ける条件では陰性になるけど、大量にロードして長時間exposeすればバンドが見られることは普通にありますよね。ノックダウンのサンプルとか、コントロールが飽和していない条件でノックダウンサンプルのバンドが消えているブロットと、コントロールが飽和する条件で弱いバンドがノックダウンサンプルで見られるブロット、どちらが適切かはコンテクストによると私は思います。前者で良い場合もありますよね。 問題は、免疫蛍光染色の場合、ネガコンの閾値が、細胞によって、あるいは細胞内でも局所によってブレるので、弱いシグナルの有無を決定する際の閾値設定が非常に困難な事です。結局「陰性」とは言い切れないので、そのように査読の返事には書かざるを得ないのですが、また色々言われそうで、ちょっと憂鬱です。

(無題) 削除/引用 No.8653-9 - 2020/02/19 (水) 05:39:34 - Palms ＞おおさん トピ主さんが最初に「過剰発現した細胞をポジコンとして免疫染色の条件設定」と書かれていまして、「「過剰発現」したものを基準にした設定で発現レベルを論じたり、検出基準の設定をするのがナンセンスだと感じ、書き込みました。 ただ、よく読んだところ、ネガコンの方との比較はきちんとされていて、私が心配した点は、トピ主さんはすでにご存じと拝察しまして、連続で訂正を下にさせていただきました。（なぜか削除ができなくて、すみません。。。）

(無題) 削除/引用 No.8653-8 - 2020/02/19 (水) 03:38:58 - おお >[Re:6] Palmsさんは書きました : > ＞ポジコンでシグナルが飽和しないレベルに合わせると、免疫染色のシグナルは完全に消えます。 > > 　これはやってはいけないと思います。自由に「ネガティブ」という結論を得られてしまいますから。ポジコンの飽和にこだわるべきではないかと思います。 少なくとも、ポジコンからみて明らかに発現が低いという主張はできます。

(無題) 削除/引用 No.8653-7 - 2020/02/19 (水) 03:35:47 - Palms ＞＞ポジコンでシグナルが飽和しないレベルに合わせると、免疫染色のシグナルは完全に消えます。 ＞これはやってはいけないと思います。自由に「ネガティブ」という結論を得られてしまいますから。ポジコンの飽和にこだわるべきではないかと思います。 　よく読んだら、ネガコンの設定の方は厳しくされているようなので、私の上記の指摘は全く不要でした。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.8653-6 - 2020/02/19 (水) 03:32:34 - Palms ＞ポジコンでシグナルが飽和しないレベルに合わせると、免疫染色のシグナルは完全に消えます。 　これはやってはいけないと思います。自由に「ネガティブ」という結論を得られてしまいますから。ポジコンの飽和にこだわるべきではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.8653-5 - 2020/02/16 (日) 06:01:37 - おお weirdと書かれてたりと、Reviewerの真意はやり取りや原稿を見てみないとなんとも言えません。また見てもわからないのかもしれませんけど。 もし本人を含め検出できている人がいるのかもしれません、（論文を書く上でいろいろ調査していると思いますが）もう一度発現という視点で検索し直して、もし見つかるなら結果の違いがなぜ起こっているのかなど考察してみるといいでしょう。 ＞微弱なシグナルの有無を判断するための条件設定は難しく、きちんと判断できる気がしません。査読者の方に寄せて「非常に弱いシグナルを検出」と結論すれば、論文が通る可能性は高まると思いますが、それが科学的に正しい事なのか、自信がないです。 すでに実験をやっているようですので、データーを示すがその点では結論は出さないくらいでもいいかもしれません。おそらくその細胞で発現が非常によわく、それに伴う生物学てき現象を見ているのでしょうから、発現に関しての詳細は論文の主張には、免疫染色のデーターは論文にあまり影響はないでしょうから。なのでありのままにデーターを出しておけばいいのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.8653-4 - 2020/02/16 (日) 00:28:44 - まっくろん 　　標的の量が少ない時、免疫沈降で濃縮してから検出するのを見たことがあります。抗体の性能が良いようなので、実験としては可能かもしれません。「無い」証明は極めて難しいことですが、「ここまでやっても駄目だよ」のを示すための候補の一つとして。

(無題) 削除/引用 No.8653-3 - 2020/02/15 (土) 23:43:50 - JM １さん、どうもありがとうございます。おそらく査読者の意図としては、ご指摘いただいたように、細胞内局在により局所であれば検出できるが、ウエスタンでは検出できない場合があり得るので、免疫染色をやりなさい、という事だと思うのですが、査読の文面上は、「ウエスタンのような検出感度が低い方法で判断するのは信じられない」くらいの感じだったので、気になってしまいました。他のポイントも合わせ考えると、この査読者は、細胞内にそのタンパクがあるはずだという立場からコメントされていると思います。私もあるだろうとは思いますが、検出できるレベルかどうかについては、実験結果から結論するよりありません。 リバイスですので要求された実験を行なっていますが、免疫染色では一部のオルガネラで非常に弱いシグナルがあるかないか、くらいの感じになっています。質問の（３）と絡むのですが、コンフォーカルの設定で、ポジコンでシグナルが飽和しないレベルに合わせると、免疫染色のシグナルは完全に消えます。ノックアウトの細胞でバックグランドがほぼ消える設定（ポジコンは完全に飽和）だと、弱いシグナルがかろうじて見える細胞があるのですが、ノックアウトのコントロールでも注意深く見ると同じようなシグナル（抗体抜きのサンプルとの比較から、自家蛍光の可能性が高いと考えています）を持つ細胞が低頻度見られます。ノックアウトでこれが完全に消えるところまで閾値をあげるとサンプルでも消えます。細胞間、あるいは細胞内でもオルガネラによって、バックグランド蛍光のレベルがばらつくため、微弱なシグナルの有無を判断するための条件設定は難しく、きちんと判断できる気がしません。査読者の方に寄せて「非常に弱いシグナルを検出」と結論すれば、論文が通る可能性は高まると思いますが、それが科学的に正しい事なのか、自信がないです。 抗体については、ウエスタンでも免疫染色でもポジコンが綺麗にワークしているので、サンプルの変性や固定により決定的な影響を受ける事はないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.8653-2 - 2020/02/15 (土) 19:25:53 - １ 発現レベルが、細胞集団内でだいたい均一ならば、一般論としては感度はwestern blottingのECL検出の方が蛍光抗体染色よりも良いように思いますしwesternでは分子量情報も加わりますから感度および特異性の点でもメリットはあるように思いますので、westernでは検出できないがIFでははっきり染まったとか、検出面でIFがwesternにまさる（ていうか両者はもともと目的が違う実験だし）ことはあまりない気がします。ただ、少数ながら変性した抗原とは反応しない抗体も時々ありますのでその分子の発現の有無が研究内容を大きく左右するならばwestern blotting以外の方法で見ることは大切かもしれません（でもそういうことは抗体の添付書類に書いてあるのでこれもあまり問題の原因にはならないですが）。 組織などでは非常に限局した部域とか特定の細胞にのみ高発現しているような場合、Westernのように組織ごとホモジナイズせざる得ないような実験だと発現のない部域・細胞のタンパク質で希釈されて試料中の相対的割合が激減して見えなくなってしまうことがあります。このような方法上の欠点を補完するため、組織化学的手法（IFとかIHC)と合わせて行うということはスタンダードなやり方となっています。培養細胞の場合でも、個々の細胞で発現レベルが異なるとかいう可能性があれば、（ある特定の反応を呈した細胞のみで発現するとか、ある特定の細胞周期で発現するとか、一過的な強制発現系で発現レベルが個々の細胞間でかなり不均一とか）Westernでは低く見積もる可能性があるので、そのミスを回避するためにもIFでも見ておくことは大切かもしれません。 抗体によっては抗原認識部位の関係で、westernでは使えてもIFとかIHCでは使えないもの、使えても固定法とかが特定の方法や条件でないとうまくいかないものもしばしばあるので添付書類などをあらかじめよく確認ください。 どのような方法でも、検出感度とか検出限界があるので厳密にいえばどンな方法でも発現していないとは結論できないし、実際、この細胞がこんなタンパク質を？みたいに意外な分子が低いレベルで発現していたりすることはあるので、正確には発現は検出限界以下のレベルとかそいういう表現をすべきなのかもしれないですね。 レビュアーも多くは公正無私ではないのでどうしても普段自分たちが主要な研究手法としている愛用している方法に肩入れしたくなるのは仕方ないので、彼らが『うちらは普段そうやってるし、当然するべきだろ普通に」と考えることが見当たらないとついweirdと感じるのはよくあります。指摘が本質的なことではないと思ったら、きちんと説明すればいいだけです。

ウエスタン陰性の細胞で蛍光免疫染色 削除/引用 No.8653-1 - 2020/02/15 (土) 09:40:31 - JM とある細胞のライセートのウエスタン（デタージェントで溶かしたサンプルと、不溶のペレットをSDSバッファーで溶かしたサンプルをパラレルで流しました）で、目的タンパクの発現が陰性（というか、測定限度未満、ポジコンはあきらかに陽性）と結論した内容を含む論文を投稿したのですが、査読が返ってきて、 「ウエスタンのみで陰性と判断するのはおかしい（実際にはweirdと書かれていました）、蛍光免疫染色と共焦点顕微鏡で確認せよ」とのコメントをもらいました。 mRNAのデータも入っているのですが、陽性の細胞と比べた相対値（1/100から1/1000の間）になっており、完全に０ではありません。 何点か、みなさんのご意見をお伺いしたいです。 （１）ウエスタンと比べて蛍光免疫染色・共焦点顕微鏡観察の方が感度が高いと一般化できるのか否か？ （２）ウエスタンで陰性の細胞において、免疫染色で陽性シグナルが見られた場合、非特異染色の可能性を否定できず、データにできないのではないか？ （３）ノックアウトの細胞をネガコン、過剰発現した細胞をポジコンとして免疫染色の条件設定を行い、その条件で共焦点顕微鏡観察した結果が陰性の場合、それで陰性と結論できるのか？ 宜しくお願いします。

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