Bio Technical フォーラム

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電気泳動の条件設定について トピック削除
No.8634-TOPIC - 2020/02/07 (金) 16:58:03 - きし
2種類のタンパク質とRNAからなる複合体を検出する条件設定(タンパク質やゲル濃度、電圧等)について質問があります。タンパク質-RNAの解離定数はそれぞれ判明していますが、タンパク質やRNAの濃度は解離定数から求めるものなのか、自分で設定するものなのか分かりません。thermofisher等でプロトコルについて見てみましたが分かりませんでした。これから大学の研究室で学ぶので大まかな手順や参考になるものなど教えていただけるとありがたいです。
　
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(無題) 削除/引用
No.8634-2 - 2020/02/08 (土) 04:39:21 - おお

ゲルシフトアッセイでは慣習的には蛋白の方は多くて１００ng（数pmolくらい）、核酸のほうはfmole程度。リコンビナントで１００ngは実際大腸菌から精製してみて思うのですが、大量に不溶画分に行く系で可溶画分のものを精製したり、場合によっては一度変性して戻すなどしてみたりする中で得られた蛋白分子のうち一体どれほどがちゃんと折りたたまれているんだろうかとか、もしそうであっても一部ちゃんと折りたたまれていれば結合活性は検出できるだろうとか思ったりしていました。そうしたら同じようなことをちゃんと書いているものがありました（以下のURL)。

核酸に関しては大過剰入れるもんだと勝手な印象を持っていましたが上記の数字を見る限りそうでもないですね。お示ししているプロトコールでは想定されたkd値を基準にそれぐらいの量にしていると書かれてますね。ただし、検出系がその量をカバーできないなら少し工夫がいるのかもしれません。None RIの場合の実験の組み方はそういう意味で確認が必要かもしれません。

http://cshprotocols.cshlp.org/content/2013/7/pdb.prot075861.full

Current protocolなどにも解説が載ってないでしょうかね。

電気泳動の条件設定について 削除/引用
No.8634-1 - 2020/02/07 (金) 16:58:03 - きし
2種類のタンパク質とRNAからなる複合体を検出する条件設定(タンパク質やゲル濃度、電圧等)について質問があります。タンパク質-RNAの解離定数はそれぞれ判明していますが、タンパク質やRNAの濃度は解離定数から求めるものなのか、自分で設定するものなのか分かりません。thermofisher等でプロトコルについて見てみましたが分かりませんでした。これから大学の研究室で学ぶので大まかな手順や参考になるものなど教えていただけるとありがたいです。
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