BioTechnicalフォーラム [ヒト血管内皮細胞の不死化]

ヒト血管内皮細胞の不死化

No.8629-TOPIC - 2020/02/06 (木) 03:03:03 - Sheep

初めて質問させていただきます。
よろしくお願いします。

研究室にHUVECのcryotubeが複数ありました。
その一つを使って実験を行いましたが、やはりP8あたりになると細胞の増殖やVEGFへの反応性などに不安が出てきました。ただ、ラボの財政状況から、新しくHUVECを購入することは困難です。

私は他のラボでレンチウイルス感染の実験を行ってきました。
またヒトの線維芽細胞の不死化もhTERTをレンチウイルスで導入することで行った経験があります。

論文やセルバンクを見ると、HUVECをhTERTで不死化したものが売られていたり使われているようですので、hTERTで不死化を行いたいです。

今のラボに残されたHUVECのcryotubeは残り4本です。P4で保存されていました。
ここから不死化したものを樹立するため、前のラボに言って、hTERTのレンチ用のプラスミドを譲渡いただきました。

ここで皆様にお聞きしたいのですが、hTERTが感染、発現さえすれば、不死化が行われるのでしょうか？
あるいは、hTERT感染は必要条件であり、十分条件にはなり得ないでしょうか？
ご教示を賜れます幸いです。よろしくお願いします。
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全10件 ( 1 ～ 10 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.8629-10 - 2020/02/07 (金) 09:11:54 - おお

ウイルスのタイターが気になるなら複数回導入する手もあると思うけど。
たとえば９６穴にまいて、２回か３回感染をリピート。多分コンフルになってくるだろうから、４８穴にまき直してまた２回か３回リピートつぎは２４穴、１２穴、６穴、１０cm Dishと言う感じ。テロメラーゼ活性が図れるように複数のウェルにまいといて、モニタリングしながら文献に出てるくらいの活性に匹敵すると思われるところで止めればどうだろうか。ま、最初から１０cmで継代しながら感染してもいいだろうけど。

あとは最初は１回にして継代をつづけて増殖が遅くなってきてから複数回感染をたたみかけでやるとか。

(無題)

削除/引用

No.8629-9 - 2020/02/07 (金) 08:11:20 - Sheep

おお様、ありがとうございます。
はい、これは読んでおりました。
確かに血管内皮細胞としてのマーカーや管腔構造を形成する能力も保持しているようなので、なんとかhTERTで不死化させたいです...

(無題)

削除/引用

No.8629-8 - 2020/02/07 (金) 06:56:32 - おお

じゃあ念の為これも貼っとくか
https://www.jbc.org/content/274/37/26141.full

(無題)

削除/引用

No.8629-7 - 2020/02/07 (金) 02:00:13 - Sheep

おお様、ありがとうございます。
お示しくださった論文は読んでいませんでした。
早速読んでみます。ありがとうございます。

(無題)

削除/引用

No.8629-6 - 2020/02/07 (金) 01:54:13 - Sheep

lipid様、ありがとうございます。

> に関しては、特段問題になるように思えないのですが、もしかして感染させたクルードの細胞集団、ヘトロなものを実験に使用したいと言う事でしょうか？

私は不死化したもので、かつ血管内皮マーカーを発現維持していればいいと考えていますので、クルードでヘテロなものを用いようと思っています。

ATCCセルバンクにはhTERTで不死化したHUVECが売られていますので、hTERTで不死化できるのだと思います。

私がトピックを立てた理由は、hTERTさえ感染発現すれば不死化は容易に得られるのかに不安があったからです。
hTERTプラスミドからウイルスを産生しても、カンパニーが売るような高タイターのウイルス液が出来るとは思っていませんので、もし仮にカンパニーの10分の1ほどのタイターしかなくても、血管内皮の一部が感染さえしてくれれば不死化されるのか、それともやはり高タイターを使ってどうにか全ての細胞に感染させるのがまず第一条件としてクリアしなければならないのかがわからないんです。

(無題)

削除/引用

No.8629-5 - 2020/02/06 (木) 11:20:18 - おお

https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S0006291X06027720?token=5C88991A9A878BFFB14BE30CDEF62903E3694BA6A2CEC4258D94329A406DA986F2371609838DBFE9A72D9466C157718F

これを見るとhTERTを入れてもある時期でグロースが一旦遅くなってますね。何らかのセレクションか変化がその時期に起こっていると推測できます。ほかの論文で染色体の以上はなかったと書かれたものもあったような。

(無題)

削除/引用

No.8629-4 - 2020/02/06 (木) 08:24:15 - lipid

素人の疑問と捉えて、笑読ください。
基本的に、間違っていたら、スルーしてください。

ちょっと良く分からないのですが、不死化させるにしても、仮にその他の機能を付加させたりしても、基本的にはクローニング後細胞の特性を個々にチェックした上で初めて実験に使用できると考えています。

なので、
>hTERTを導入するためのレンチウイルスに感染した細胞の100％が不死化するのか、感染した細胞の中でもごくわずかな選択した細胞が感染するのかは論文からはわかりません

に関しては、特段問題になるように思えないのですが、もしかして感染させたクルードの細胞集団、ヘトロなものを実験に使用したいと言う事でしょうか？
クローニング前提ですので、効率って問題になるのでしょうか？

結局は、HUVECでの論文がない限り、してみないとわからないように思います。
文献をお調べになったとの事ですのでご承知だと思いますが、hTERTだけでは不死化できず、他の不死化にかかる遺伝子をコトランスフェクションして不死化できたものもあります。
ただし、何故かは言及されていません。
機序が不明である以上、必要十分条件を推測することはできず、現在はやってみるしかないのかなと推測します。

(無題)

削除/引用

No.8629-3 - 2020/02/06 (木) 07:42:00 - Sheep

おお様

コメントありがとうございます。
上記しましたように、論文はすでに検索していまして、hTERTで不死化している論文を見つけています。

ただしそれが十分条件かはわからないので、トピックを立てさせていただきました。
どうもご不快にしてしまったようで、本当に申し訳ありませんでした。

私の質問はそれが十分条件か否か、です。
手元の細胞が限られていますので、hTERTを導入するためのレンチウイルスに感染した細胞の100％が不死化するのか、感染した細胞の中でもごくわずかな選択した細胞が感染するのかは論文からはわかりませんでした。論文のほとんどが不死化したものを増幅して実験を行なっており、hTERTによる不死化効率までは論文の中では見ておりませんでした。私がhTERTで不死化した細胞を仮に樹立して、その細胞を使って実験を進めたとしても、論文にはhTERTによる不死化効率のデータは出さないと思います。それは本旨からずれていると思うためです。

ご不快にしてしまい、大変申し訳ありませんでした。

(無題)

削除/引用

No.8629-2 - 2020/02/06 (木) 03:30:03 - おお

えっと的確に答えるために論文を見直してからコメントするとして、そのまえに、なぜご自身で論文を調べないんですか？

ヒト血管内皮細胞の不死化

削除/引用

No.8629-1 - 2020/02/06 (木) 03:03:03 - Sheep

全10件 ( 1 ～ 10 )　前 | 次　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

〔使い方〕

「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。