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(無題) 削除/引用 No.8624-4 - 2020/02/05 (水) 10:34:51 - おお ３つプライマー入れてもいいとは思うけど、あまり系を複雑にするとノンすぺがでたり、系が働かなくなる可能性が増えてきますので、M13 F/Rでいいんじゃないのかなと思います。 どうしてもというなら、M13Rとその遺伝子のFのプライマーだけでやって反対に入ったほうは拾わないと決めるか。 ちゃんとクローニングの系がワークしていたら、コロニーPCRは２度でまでコロニーからミニプレップしてしまうほうが速いです。

(無題) 削除/引用 No.8624-3 - 2020/02/05 (水) 09:52:30 - ちき 3つプライマーを入れることは全然問題ありませんし、すでに回答があるようにM13 F/Rでもいいと思います。 そもそもの問題として、コロニーPCRでスクリーニングしなければならないほど効率の低いクローニングなのでしょうか。10個ひろってpositiveが出ないようなクローニングは何らかの問題をかかえてると思います。

(無題) 削除/引用 No.8624-2 - 2020/02/05 (水) 09:27:42 - ... M13のF/Rでやればいいのでは？

Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit 削除/引用 No.8624-1 - 2020/02/05 (水) 09:19:28 - ねこまま Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kitを購入して、PCR産物のクローニングを行う予定ですが、この時にコロニーPCRを行いたいです。 bluntクローニングなので挿入の向きはコントロールできません。 また、ノックインのためのドナーベクターなので向きは正直どちらでも構いません。 とにかくPCR産物がクローニングされたものが取れればいいという状況です。 コロニーPCRを利用しようと思いますが、ベクター上のM13のFまたはRのプライマーと、私の興味ある遺伝子のFプライマーの3種を1つのPCRチューブに入れ、とにかくバンドが出たものをピックすればいいのか、それともやはり1つのチューブには2つのプライマーのみ（つまり、M13Rと私の遺伝子のFのプライマーペアか、M13Fと私の遺伝子のFのプライマーペアか）でPCRは行うべきでしょうか？ 後者の場合だと同じコロニーを2度つつく必要があり、手間も二倍にはなりますが、手間をおしむわけではありませんが、みなさんはこんな時どうcPCRをされているのかなと思い、質問させていただきました。

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