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(無題) 削除/引用 No.8616-10 - 2020/02/05 (水) 06:48:30 - heita311 山道を登りながらが鬱陶しい様 ＞他の生命現象一般に言えると思いますが、全く活性化していないとか、100%活性化してるとかいうことはあまりなくて、あくまで程度問題で、定常状態であっても低いレベルで何かしている方が普通と思います。こうでなくてはおかしいとか、あまり0か100かみたいな２進法的な発想でなく、あくまでもデータを尊重して柔軟に考えたほうがいいです。 ありがとうございます。データを見るときにまず先入観から入ってしまう傾向がありました。もっと柔軟に解釈してみます。活性化の程度に関してもご教示いただきありがとうございました。 大変お世話になりました。

(無題) 削除/引用 No.8616-9 - 2020/02/04 (火) 21:55:48 - 山道を登りながらが鬱陶しい 他の生命現象一般に言えると思いますが、全く活性化していないとか、100%活性化してるとかいうことはあまりなくて、あくまで程度問題で、定常状態であっても低いレベルで何かしている方が普通と思います。こうでなくてはおかしいとか、あまり0か100かみたいな２進法的な発想でなく、あくまでもデータを尊重して柔軟に考えたほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.8616-8 - 2020/02/04 (火) 20:47:51 - heita311 おお様 ＞無刺激でNFκBの転写活性が落ちてないという解釈だったのではないですか？ ありがとうございます。すみません、おっしゃる通り無刺激では転写活性が落ちていませんでしたので、仮定の話をお聞き致しました。 ＞がん細胞のサバイバルに関与するという事から薬が見つかっているので、定常状態でもある程度の役割があるのかもしれません。いま細かく調べられる環境にないのでご自身でも調べてみたらどうですか。個人的にはこういうものは0か１かという風にはならないだろうという感覚です。 本当に有難うございます。確かに無刺激でもわずかにNFkBは核内に存在しているようです。自分できちんと調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.8616-7 - 2020/02/04 (火) 20:22:26 - おお >もし刺激なしの場合でも、因子AのノックダウンでNFκBの転写活性が落ちて、かつ末梢の因子の発現も落ちていれば、それは刺激なしの定常状態でもNFκBはわずかに働いていて、それが抑制された結果だと考えても筋は通りますでしょうか。 データーを見てないので可能性としてだけで言うとあると思います。といいますか、無刺激でNFκBの転写活性が落ちてないという解釈だったのではないですか？ ぐぐっても無刺激で核にある程度NFκB構成蛋白が見られる図が複数見られます。 がん細胞のサバイバルに関与するという事から薬が見つかっているので、定常状態でもある程度の役割があるのかもしれません。いま細かく調べられる環境にないのでご自身でも調べてみたらどうですか。 個人的にはこういうものは0か１かという風にはならないだろうという感覚です。

(無題) 削除/引用 No.8616-6 - 2020/02/04 (火) 16:15:49 - heita311 重ねて申し訳ありません、質問なのですが、 もし刺激なしの場合でも、因子AのノックダウンでNFκBの転写活性が落ちて、かつ末梢の因子の発現も落ちていれば、それは刺激なしの定常状態でもNFκBはわずかに働いていて、それが抑制された結果だと考えても筋は通りますでしょうか。 基本的には刺激がなければIkBaはほとんどリン酸化されずにNFκBは細胞質にとどまっているとは思うのですが。 重ねて質問して申し訳ありません。。

(無題) 削除/引用 No.8616-5 - 2020/02/04 (火) 15:58:08 - heita311 山道を登りながらが鬱陶しい様 ＞可能性のありそうな経路の関与を抗リン酸化タンパク質抗体によるWBやsiRNAでKDして調べるとかはできると思います。もちろんシグナル伝達を調節するのはリン酸化だけではありませんのでこれで十分ということではないですが、予算があるならば、phosphoproteomicsなどで、細胞全体のシグナル伝達関連分子のリン酸化動態を網羅的に調べるとかで手がかりが得られるのではないでしょうか。 ご指摘ありがとうございます。そういった網羅解析手法は思いつきませんでした。本当に有難うございます。勉強して検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.8616-4 - 2020/02/04 (火) 15:56:06 - heita311 おお様 ＞因子AがNFκB以外の経路でも末梢の因子の遺伝子発現を制御できる可能性。末梢の因子の遺伝子のプロモーターにNFκB以外のエンハンサー結合領域がありませんか？ ご指摘ありがとうございます。IL6やMMP13はNFkB(→HIF2a)以外にもC/EBPbなど様々な調節を受けており、おっしゃる通り、因子Aが他の経路を介しても作用している可能性は充分考えられるかと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8616-3 - 2020/02/04 (火) 09:39:31 - 山道を登りながらが鬱陶しい。 細胞内シグナル伝達の経路図を見ると様々な経路が複雑に交差しているのがわかると思います。このことはある受容体からの一つの刺激が単一の経路のみに影響を与えて、ある事象を成立させるということが現実には稀と思われます。またこれは細胞の種類などでも変わってきますので単純な話ではありません。可能性のありそうな経路の関与を抗リン酸化タンパク質抗体によるWBやsiRNAでKDして調べるとかはできると思います。もちろんシグナル伝達を調節するのはリン酸化だけではありませんのでこれで十分ということではないですが、予算があるならば、phosphoproteomicsなどで、細胞全体のシグナル伝達関連分子のリン酸化動態を網羅的に調べるとかで手がかりが得られるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8616-2 - 2020/02/04 (火) 08:52:12 - おお 因子AがNFκB以外の経路でも末梢の因子の遺伝子発現を制御できる可能性。末梢の因子の遺伝子のプロモーターにNFκB以外のエンハンサー結合領域がありませんか？

刺激なしの状態でのNFκB 削除/引用 No.8616-1 - 2020/02/04 (火) 08:33:03 - heita311 この度はお世話になります。 まだまだ研究歴の浅い者です。ご教示ください。 軟骨細胞においてある因子AをsiRNAにてノックダウンし、刺激をもちいて差をみやすくし、NFκBのルシフェラーゼ活性及び、末梢のIL6やMMP13などの発現をreal time PCRで確認してみました。 結果、刺激ありの場合、NFκBの転写活性はノックダウンで抑えられ、末梢の因子の遺伝子発現もノックダウンで抑えられました。 一方、刺激なしの場合、末梢の因子の遺伝子発現はノックダウンで下がったものの、NFκBの転写活性はノックダウンでは有意には変わっていませんでした。 この場合、刺激なしの結果の解釈がどうすればよいか非常に悩んでいます。 ある因子AがNFκBのIκBαのリン酸化に関わっている、ということはウェスタンの結果から考えているのですが(つまり因子AはNFκBの上流に位置し、NFκB経路を亢進させる因子)、刺激ありの場合はそれでうまく筋は通りますが、刺激なしの場合で末梢の因子にノックダウンにより差が出ることがなぜなのか思案しています。何度やっても同じ結果であり、この結果は真実ではないかと考えております。 もし何か、こういった可能性はないかなど、ご教示いただけないでしょうか。

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