Bio Technical フォーラム

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PCR後のシーケンスに関して トピック削除
No.8610-TOPIC - 2020/01/31 (金) 13:51:25 - 理系大学生
こんにちは。卒論発表を控えているM4大学生です。とても些細な、しかし教授には聞けないような内容ですのでここで質問させてください。

バクテリアの同定をするために、PCR⇒product精製⇒サイクルシーケンス反応を行い、最後はサンガ―法で菌を同定するメソッドとなっています。
サンガ―法を行う当日、前日までに冷凍保存していた精製沈殿物にホルムアミドを加え、混和、94℃で2分インキュベートしました。しかし、
施設の時間内に準備を終えることが出来ず、60サンプル分シーケンスを行うことが出来ませんでした。そこで質問なのですが、今にも持っていける状態のサンプルを冷凍保存し、別日に解答し、シーケンスに掛けることは可能でしょうか?数が膨大なため、シーケンス結果が多少乱れてもこのまま行いたいと自分は考えています。よろしければご回答ください
 
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No.8610-5 - 2020/02/01 (土) 01:35:23 - おお
ま大丈夫だと思います。その手のことは探せばどこかに書かれているような気がします(みたことがあるような)。
凍結保存するなら急速な凍結のほうがベターでしょう。また使う前に温め直すという話もあったかな。
そういえば、むかしテクニシャンにシーケンスかけてとお願いしたら、そのプレートを脇に置いといて、一度かけたプレートを戻してかけてしまって、次の日私のプレートをかけ直してくれたっていう事がありました。

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No.8610-4 - 2020/01/31 (金) 16:52:53 - AP
全く問題なし。
HiDiに溶かしたところで冷凍保存することもあるし、
run済みのサンプルの残りを保存しておいて、後日、泳動し直すこともある(自動キャピラリー電気泳動ならトラブルは少ないだろうけど、スラブゲルでやっていたことは、泳動したもののゲルのできが悪くてやり直しなんてことはザラだった)。

キャピラリーシークエンサーも出始めの頃は一本キャピラリーだったからね(ABI310)。それで48サンプルとか96サンプルとかセットしておいて、順番に1サンプルあたり1時間とか3時間かけて泳動していくんだ。サンプル数をフルでセットしたら、最後のサンプルが泳動されるのは何時間後だ?

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No.8610-3 - 2020/01/31 (金) 14:55:45 - ちき
BigDyeを使っているのだったら、サーモのテクニカルサポートに電話すればすごく親切に相談にのってもらえます。

これに限りませんが、どうしてメーカーに尋ねるということを第一選択肢にしない人が多いのか、不思議ではあります。

(無題) 削除/引用
No.8610-2 - 2020/01/31 (金) 14:26:18 - T-2
遮光して-20度で保存すれば大丈夫だと思う。
けど正直に教授に言うべきじゃない?

PCR後のシーケンスに関して 削除/引用
No.8610-1 - 2020/01/31 (金) 13:51:25 - 理系大学生
こんにちは。卒論発表を控えているM4大学生です。とても些細な、しかし教授には聞けないような内容ですのでここで質問させてください。

バクテリアの同定をするために、PCR⇒product精製⇒サイクルシーケンス反応を行い、最後はサンガ―法で菌を同定するメソッドとなっています。
サンガ―法を行う当日、前日までに冷凍保存していた精製沈殿物にホルムアミドを加え、混和、94℃で2分インキュベートしました。しかし、
施設の時間内に準備を終えることが出来ず、60サンプル分シーケンスを行うことが出来ませんでした。そこで質問なのですが、今にも持っていける状態のサンプルを冷凍保存し、別日に解答し、シーケンスに掛けることは可能でしょうか?数が膨大なため、シーケンス結果が多少乱れてもこのまま行いたいと自分は考えています。よろしければご回答ください

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